基因敲除的基本技术路线如下：
（一）构建重组基因载体
绝大多数的基因敲除策略都是基于同源重组 （homologous recombination）的机制，其基因载体包括载体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基因等非同源序列，其中同源序列是影响同源重组效率的关键因素。通常，重组基因载体包含有两段与敲除目标位点两端同源的序列，中间一段是带有某种药物筛选标记的非同源目的序列。根据载体与靶基因组同源序列双链断裂位点位置的不同，基因载体通常分为两种：
1．插入性载体(gene-insertion vector) 断裂位点位于同源序列区域内，选择基因紧邻同源目的序列。基因重组时整个载体整合到染色体靶位点上，载体 DNA 同源序列与染色体靶位点进行一次同源重组。
2．置换型载体(gene-replacement vector) 断裂位点位于同源序列区域的外侧或两侧，选择基因位于同源目的序列内部或外侧。基因重组时以载体的同源序列取代染色体靶位序列，载体DNA 同源目的序列与染色体靶位点进行两次同源重组。目前，大多数基因敲除实验都采用置换型载体进行。
（二）重组DNA转入受体细胞核内
常用于基因敲除的靶细胞是小鼠ES细胞。外源DNA导入的方式有显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒法等，目前应用较多的是显微注射法。见基因转移技术。
（三）中靶阳性细胞的筛选
基因敲除的技术路线虽不复杂，但由于在高等真核细胞内，外源DNA与靶细胞DNA序列自然发生同源重组的机率非常低，只有大约百万分之一，所以，同源重组的筛选和检测也因而成为了基因敲除技术的关键环节。
常用的筛选方法有两类
1．物理筛选方法 主要是PCR筛选方法，其原理是通过在目的突变基因序列中引入特定的PCR引物序列，利用 PCR方法直接检测转化细胞的 DNA结构，然后根据特定扩增 DNA片段的有无,来鉴别中靶阳性细胞克隆。
2．遗传筛选 包括正向筛选和正负双向筛选两种，正向筛选中，又有启动子缺失筛选法和poly- A缺失筛选法；正负双向筛选系统是neo- HSV- tk 。
⑴ 启动子缺失筛选法 原理是在重组基因载体的目的片段中插入一个启动子缺失的正向选择基因 neo neomycin，同时，目的基因片段也不包含该基因的启动序列。如果基因载体和细胞基因组发生同源重组，则正向选择基因可以在靶位点基因启动子的作用下得以表达，使阳性细胞具有 G418 抗性，从而在选择培养基中得到同源重组阳性克隆。
⑵ Poly- A缺失筛选法 Poly-A缺失筛选的载体设计与启动子缺失的设计基本相同，当打靶基因不能被诱导表达时，则考虑选用poly- A缺失敲除策略。Poly - A 缺失的正向选择基因 neo位于载体目的片段中, 由于neo 基因转录终止信号的缺失,其表达受到抑制。在重组阳性细胞中，neo基因通过利用基因组靶位基因的转录终止信号得以表达，使阳性细胞获得 G418 抗性，并得以筛选出来。
⑶ 正负双向筛选系统（ positive and negative selection，PNS） 该系统不受靶位基因功能和表达情况的影响，可以同时使用于选择标记基因和非选择标记基因的敲除。克服了正向筛选方法在这方面的局限。PNS采用置换型载体，该载体含有正负选择基因各一个，正向选择基因多为neo基因，插入载体的同源序列中；负向选择基因常用HSV-tk基因，置于同源序列的外侧。同源重组时，载体的同源区发生重组，同源区以外部分将被切除，所以在粗刈槭保瑃k基因将被切除而丢失。而在随机整合时，所有的序列均保留（包括tk基因）。胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒性的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性核苷酸而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。在同源重组时，细胞对G418和GANC都有抗性，随机整合时只对G418有抗性，而对GANC敏感，细胞将被杀死。未进行任何方式整合的细胞则被G418杀死。用G418作正筛选，可得到含有neo基因的细胞株，然后再用丙氧鸟苷做负筛选，淘汰含有tk基因的细胞株，就可以得到不含tk基因的同源重组细胞株。
正向筛选标记基因Neo具有双重作用，一方面导致了靶基因的插入突变；同时作为重组细胞的正向筛选标志，该基因产物可使细胞在含有新霉素的培养基中生长。类似的正负基因还有一些，例如gpt (对6 - 巯基尿嘧啶敏感)和dta (diptheria 毒素,直接毒性作用)。
（四）将阳性细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。
通过观察转基因小鼠的生物学形状的变化，进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学性状的改变，达到研究目的基因的目的。见基因转移技术有关内容。 | 
