染料染色法测定细胞数

1）结晶紫检测法

1．在96孔细胞培养板各孔中加0.1ml含5×10⁴～10×⁴ WEHI-164细胞的培养液（含10％小牛血清的RPMI-1640培养液），37℃ 5％ CO₂的二氧化碳培养箱中培养2～3小时，让细胞帖壁。

2．用RPMI-1640培养液10倍递次稀释TNF标准品，根据需要3～5倍递次稀释待检样品，每孔加0.1ml稀释的标准品或待检样品，每个稀释度3个重复孔。对照孔6个，3个阳性对照孔各加0.1ml含4μg TNF的RPMI-1640培养液，3个阴性对照孔各加100μl RPMI-1640培养液。继续培养18～24小时。

3．甩去培养液，用PBS小心洗涤一次，每孔加0.1ml 10％甲醇溶液固定细胞30秒钟。

4．吸去甲醇溶液，每孔加0.1ml结晶紫染液，室温中放置20分钟。

5．轻轻甩去染色液，用蒸馏水洗涤各孔，将培养板倒置于吸水纸上吸干水分。自然干燥或37℃烘干。此板可以在室温中长期保存。

6．测定前，每孔加0.1ml 33％醋酸脱色，充分振荡后在570nm处测定光吸收度。用光吸收度（OD）值对样品稀释度作图，比较标准品曲线和待检样品曲线即可得到待测样品中的细胞因子活性

2）NBB检测法

1．在用细胞因子处理靶细胞以后倾去培养液，倒置培养板于吸水纸上吸干培养液。再用100μl磷酸缓冲盐水小心洗去死细胞，用吸水纸吸干培养液。

2．每孔加100μl NBB染液，室温中染色30分钟。轻轻染液。用吸水纸吸干染液。

3．每孔加100μl福尔马林固定液固定15分钟。用自来水轻轻洗去固定液，倒置培养板，用吸水纸吸干染液。

4．每孔加150μl 50mmol/L氢氧化钠。轻轻振荡培养板直到染料全部溶解并均匀分布。在分光光度计上读取各孔在620nm处的光密度（OD）值。计算TNF的活性。

3）美蓝染色检测法

1．用细胞因子处理靶细胞，在含100μl细胞培养液的检测孔中，每孔加0.02ml 25％戊二醛固定活细胞15分钟，用自来水缓缓洗去死细胞和固定液。

2．每孔加0.1ml 0.05％美蓝染液，染色20分钟，用自来水缓缓冲净染液，晾干。

3．每孔加0.2ml 0.33mol/L盐酸溶解美蓝，振荡混匀。在665nm波长处测定光吸收度。计算TNF的活性。

4）中性红染色检测法

1．用细胞因子处理靶细胞，在含100μl细胞培养液的检测孔中，每孔加50μl 5％中性红染液。继续培养2小时。

2．小心倒去培养液。用200μl Hanks液洗涤细胞1次。小心倒去培养液，减少细胞丢失。

3．每孔加100μl脱色液，在摇床中轻轻摇晃溶解30分钟。在550nm波长处测定OD值。