|
植物组织培养是把植物的器官，组织以至单个细胞，应用无菌操作使其在人工条件下，能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织。这一过程称为“脱分化作用”，已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称“再分化作用”。植物激素在此过程中起着重要的作用，吲哚乙酸（ IAA ）和 6 –苄基氨基腺嘌呤（ 6 – BA ）的比例，决定了根和芽的分化。
近年来，组织培养作为一种研究技术，已广泛地应用于许多学科中，它不仅对理论研究有重要意义，并已展现了十分广阔的应用前景。
一、原理
植物组织经过脱分化作用，形成愈伤组织，经过再分化作用，愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。早在 1957 年 Skoog 即发现培养基中植物激素的类型和它们的比例，对再分化过程起着重要的作用。
二、试剂与仪器设备
（一）试剂
• 乙醇。
• IAA 或 2 ， 4 – D 。
• HgCl 2 （或次氯酸钠）。
• 6- 苄基氨基腺嘌呤（ 6-BA ）
• MS 培养基（见附录）。
（二）仪器设备
培养室，高压灭菌锅，水浴锅，解剖刀，三角烧瓶（ 100mL ），烧杯，量筒，培养皿，棉线，接种箱或超净工作台，分析天平，长镊子，剪刀，容量瓶，移液管，牛皮纸。
三、实验步骤
1. 配制培养基
（ 1 ）愈伤组织诱导培养基： MS 培养基（蔗糖含量为 10 g/L ， 2,4 – D 含量为 2 mg/L ，琼脂 10 g/L ）。
（ 2 ）试验培养基：在 MS 培养基中按表 33 – 1 加入 IAA 和 6–BA 。
吲哚乙酸先用少量 0.1 mol/L NaOH 溶解， 6- 苄基氨基腺嘌呤先用少量 0.1 mol/L HCl 溶解，然后用蒸馏水稀释，再加入培养基中。
表 33 – 1 试验培养基中 IAA 和 6 – BA 含量
|
序号 |
IAA （ mg/L ） |
6-BA （ mg/L ） |
相对比值 |
|
1 |
0 |
2.0 |
|
|
2 |
0.2 |
2.0 |
1:10 |
|
3 |
0.5 |
2.0 |
1:4 |
|
4 |
1.0 |
2.0 |
1:2 |
|
5 |
2.0 |
2.0 |
1:1 |
|
6 |
2.0 |
1.0 |
2:1 |
|
7 |
2.0 |
0.5 |
4:1 |
|
8 |
2.0 |
0.2 |
10:1 |
|
9 |
2.0 |
0 |
|
2. 培养基灭菌
将配好的培养基加入琼脂加热溶解，调至 pH 5.8 ，趁热分装于 100 mL 三角烧瓶中，每瓶约 20 mL 。待培养基冷却凝固后，用一层称量纸和一层牛皮纸包扎瓶（管）口，并用棉线扎牢，然后在高压灭菌锅中 121 ℃（ 1 kg/cm 2 ）下灭菌 20 min 。取出三角烧瓶放在台子上，冷却后备用。接种操作所需的一切用具（如长镊子、解剖刀、剪刀等）及灭菌水，需同时灭菌。
3. 诱导产生愈伤组织
（ 1 ）取健壮的烟草茎数段，每段约 5 cm 长，于烧杯中用 0.1% 氯化汞（升汞）浸泡 20 min ，取出用无菌水洗 3 ～ 4 次，置于无菌培养皿中，在接种箱中按无菌操作要求剥去外皮（接种箱事先用紫外灯灭菌 30 min ），用解剖刀切成 5 mm 厚的圆片（弃去开始一片和最后一片），用长镊子将它接种在诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶接种 4 片，接种后扎好瓶口。
（ 2 ）将已接入植物组织（外植体）的三角烧瓶，培养在 25 ℃温室中，每星期检查 l ～ 2 次，剔除材料已被杂菌污染的三角烧瓶， 3 ～ 4 周后产生愈伤组织。
（ 3 ）选取愈伤组织生长良好的三角烧瓶，用解剖刀将愈伤组织切下，转移到含有不同激素的试验培养基中（也可以连同原来的外植体一起转移），每瓶放 1 ～ 2 块，仍培养在 25 ℃温室中，每周 1 ～ 2 次观察不同处理的三角烧瓶中，愈伤组织分化情况，直至长出根和芽。长成的幼小植株即为“试管苗”，可移栽于花盆中。
上一篇：常见细胞系细胞培养基应用选择 下一篇：免疫磁珠方法分选细胞
|
