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RT-PCR经验浅谈
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发布时间：2007-01-26
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做RNA病毒基因的RT-PCR成败的关键首先在于RNA模板的制备。本人三年前做过一个正链RNA病毒全基因组分段扩增，设计方案是将全基因组分成7个片段，0.6kb-3.3kb不等，分别进行RT-PCR扩增，刚开始的三个月，我们课题组三个人辛辛苦苦，什么招都想过了，结果连一个片段都没有拿到。后来有一个周末，我一个人安安静静做了一天，PCR跑胶的结果足以让我兴奋一个月：一下子隐隐约约出了3个片段！！！紧接着把胶里的弱带切下，水溶并后做二次扩增(注：跑胶总会吧，在UV下，参照marker，将特异性高，且与预期大小相同的DNA带切出，放在一个ep管里，加入适量无菌水，用枪头将胶反复搅碎，高速离心，小心吸取2ul上清用作模板，进行第二次PCR扩增)很快，三个预期的片段都得到了理想的扩增。不到一个月，12kb的全基因组各片段全部收归囊下。
我这次成功的关键在于：提取RNA时，收集沉淀这一步。离心速度不要低于13000rpm（r=5cm），提高离心速度、延长离心时间，在离心前的沉淀也尽可能在低温下长时间进行，这些时我本人总结出来的经验。在后来的实验中，几乎每次RT-PCR都非常顺利，除了材料本身就没有目标基因。
这一次谈一下逆转录酶和逆转录反应的问题，在一般的逆转录反应中，较常用的是MMLV（鼠源的）和AMV（禽源的）两种，现在更有各家公司推出的耐热的（50-60度）、超长片段的逆转录酶，这方面具有专长的数gibco（现在并购于invitrogen）。
我们实验室使用的一般是MMLV，鼠源的酶，虽然活性比较低一点，但是对应的RNaseH活性也很低，在长时间的逆转录过程中，不会造成模板的降解，获得cDNA的几率大，适用于较长的cDNA链的合成。对于从细胞培养物中利用RT-PCR方法扩增mRNA丰度低的基因也很有效。但是AMV也有其自身的优点，酶的活性很高，扩增1kb以下的基因时比较常用，我知道临床上血液检测中有时使用AMV，省时，也省试剂。
另外，MMLV逆转录反应的条件比较好掌握，反应液的组分简单，AMV的反应液有的需要添加焦磷酸钠（这种试剂不好找到）。
反应温度最好每次都控制不变，MMLV我每次都使用37度，虽然mannual上说使用特异性引物可以升到42度进行逆转录反应，但是有一次42度没有扩增结果，改为37度却扩出了所需要的带（使用的20mer特异性引物），从此以后我一直使用37度，后来的结果也还可以。
长片段逆转录，比如某些RNA病毒的全基因组RT-PCR扩增，10kb左右，可以选用上面提到的耐热、RNaseH-的逆转录酶，可能比较贵一点，但是很多文献报到能够得到很好的扩增，本人尝试过，说实话，可能没有太认真去优化条件，很遗憾连设计的6kb都没有得到扩增产物。由此，我建议大家不要轻易尝试这个方法，一则扩增的难度确实存在，另外，扩增的忠实性不能得到很好的保证。不同的实验目的也不一样，一下子得到这样长的片段，后续的改造也很困难。
还有一个需要指出的问题是，有些同行喜欢一下子提很多RNA，加保护剂如RNase inhibiter等，冻存，以后长期使用，我不推荐这样做。RNA在低量存在时非常容易降解，任何保存方法都比不上不保存^_^，我的做法是马上做RT，不吃饭也要做上去，为了省去日后不尽的麻烦，切记切记！
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