多数的siRNA表达载体依赖RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段45—50nt的发夹结构RNA（small hairpin RNA, shRNA）在哺乳动物细胞中的表达,shRNA在细胞内会自动被加工成为siRNA，从而引发基因沉默或者表达抑制。这一类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子等。采用RNA pol III启动子的原因是由于它有明确的启始和终止序列，总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到4—5个连续的U即终止，并且转录产物在第二个尿嘧啶处被切下来，非常精确，而且还可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA。转录出的RNA形成发卡样结构后，会在3’端形成2个突出的尿嘧啶，这类似于天然的siRNA,因而有利于双链RNA诱发RNAi。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火后克隆到相应载体的pol III 启动子下游。克隆的过程需要几天的时间，也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。
先在体外构建能表达双链RNA的载体，再将载体转移到细胞内在细胞内合成出双链RNA，不但能增加有效转染细胞的种类，而且在长期稳定表达载体的细胞株中，双链RNA能够长期发挥阻断基因的作用。
现在有多个报道说通过质粒表达siRNAs同样可以抑制特定基因的表达。当这种带有PolIII 启动子和shRNA编码序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达，抑制范围包括外源基因和内源基因。
腺病毒是体内转基因的常用载体。Xia HaiBin等用腺病毒做载体，在体内和体外表达dsRNA,并成功的阻断了基因的表达，从而实现了成体动物的基因敲除。
最近多个厂家开始研究逆转录病毒和其他病毒载体用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便。
主要优点：
1.是唯一可以进行长期研究的方法。双链RNA只能短暂抑制哺乳动物细胞的基因表达，而具有发卡结构的双链RNA能够增加阻断基因表达的时间。在小鼠畸胎瘤细胞，胚胎干细胞，C2C12细胞中，用长链具有发卡结构的双链RNA有效的阻断了报告基因的表达，在稳定表达具有发卡结构的双链RNA的细胞株中，报告基因的表达被长期的阻断了。带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选，也有助于富集带质粒的细胞。这也可以帮助解决一些难转染的细胞由于转染效率低造成的问题。
2.由于质粒可以复制扩增，相比起化学合成来说，能够显著降低制备siRNA的成本。
适用：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。长期研究。
不适用：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。
