PCR－RFLP法

1）提取细胞总DNA

方法同前。

2）PCR扩增引物的设计

1．引物长度一般为15～30bp，G＋C含量应在45％～55％之间。

2．应避免连续出现4个以上的单一碱基。

3．不能含有自身互补序列。

4．两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体。

5．与非特异扩增序列的同源性应小于70％，或少于连续8个互补碱基。

6．扩增HLA-D区基因多态性区段的引物应在该区第二外显子或高变区的边缘。

3）PCR扩增

1．每100μl反应体系中分别加入：缓冲液10μl，引物各25pmol，DNA 1～2μg，10μl dNTPs，混合均匀后在95～97℃变性5～10min。

2．加Taq DNA聚合酶2U，液体石蜡50μl覆盖放置水分蒸发，将样品置PCR扩增仪中完成扩增反应，变性，退火，延伸温度时间及Mg^2＋的浓度随扩增引物及区段的不同而改变。

4）限制性内切酶消化

取5μl PCR产物分别用2个单位限制性内切酶（如HinfI）在总体积为12μl的反应体积中酶解，37℃保温2～3h。

5）凝胶电泳

12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，200V，3h，用0.5μg/ml溴化乙锭（EB）染色30min，照相分析图形。