|
聚合酶链反应（PCR）
聚合酶链反应（polymerase chain reaction）技术是一种在体外由引物介导的DNA序列酶促合成反应，可以增加靶基因的拷贝数达百万倍,极大的提高了检测灵敏度，被广泛的应用于分子生物学的各个领域。
⑴ PCR的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至低于引物Tm值5℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制。延伸温度以70-75℃为宜，因为此时Taq的活性最佳。
链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
⑵ PCR的反应体系 模板DNA、特异性引物、耐热DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、一价阳离子K+、维持PH值的缓冲液
RT-PCR
PCR指以基因组DNA作为模板进行体外扩增反应，而RT-PCR则指以mRNA作为模板直接进行包括了反转录和PCR扩增的过程。即首先利用反转录酶将RNA反转录合成cDNA后（RT），再以cDNA为模板，进行PCR操作。也可采用单管RT-PCR一步法（如德国宝灵曼公司的Titan One Tube RT-PCR system）使步骤更为简单。
反转录体系包括dNTP、DTT、Rnase（RAN酶抑制剂）、寡聚胸腺嘧啶核苷酸引物、随机六核苷酸引物、MMLV反转录酶、缓冲液及RNA模板，可使用现成的试剂盒。
RT-PCR的应用
⑴基因表达检测
目前PCR技术只能扩增DNA模板，对RNA 模板不能直接扩增。mRNA反转录生成的cDNA 可作PCR的模板进行扩增，这种mRNA反转录后进行的PCR扩增称为RT-PCR。RT-PCR比Northern 杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。
用该方法先后扩增，检测了许多不同类型的细胞、组织和器官的mRNA。当然，仅仅检测mRNA并没有新颖之处，它的新颖在于能对10-1000个细胞的RNA进行分析。所需起始物质比通常的低很多，这使得研究者能设计并进行以前看是不可能进行的实验。例如研究血细胞生成的研究人员经常用群体分析确定生长因子或环境对特殊细胞系发育的影响。经常部到的一个问题是:群体细胞产生的何种生长/分化因子会影响其本身的发育。现在可以确信，利用RNA/PCR技术能够对数百个群体的mRNA对任何与生长或分化有关的因子进行分析。而用常规的杂交或抗体检测方法来分析它们是极其因难、甚至是不可能的。RNA/PCR技术在研究转基因动物方面将非常有用。我们常常不仅要知道在动物体内转移的基因是否表达，而且要知道是在哪些细胞．组织或器官中表达。随着RNA/PCR检测灵敏度的提高，能够检测转基因动物的多个部位而不必为取样而将它处死。我们还可以列举许多这样的例子，但我们留给读者一些有关检测方面的设想。
⑵用于诊断的RNA序列的扩增
在许多情况下，一个特异性的RNA分子可作为感染或遗传/癌疾病的诊断。在反转 录病毒疾病领域中，检测与具有侵染活性密切相关的反转录病毒RNA基因组或特异转 录子是否存在是非常重要的。现已对HIV-1病人，HTLV-1，2以及Moloney MulV的细胞 株进行了研究。也可以用RNA/PCR比较容易地检测出常见的感冒病毒即人鼻病毒。对 RNA和DNA病毒的RNA转录子的分析有利于对病毒的潜伏期，复制期等生活周期进行研究。
在某些类型的癌细胞中有新的mRNA表达。如慢性骨髓性白血病(CML)．某些急性淋巴白血病(ALL)和急性骨髓白血病(AML)，只在病人的白细胞中发现有嵌合的mRNA (BCR-ABL)。此嵌合mRNA是诊断此类疾病存在的良好依据。在许多肿瘤的治疗过程 中，肿瘤细胞对化学治疗具有抗性。DNA水平的扩增并不一定导致表达的增加，但大 量相应的mRNA的存在则使表达增加。DNA水平的扩增并不一定导致表达的增加，但大 量相应的cDNA的存在则使表达增加。用RNA/PCR方法来分析复合抗药性(MDR)10基因和 胸腺核苷酸合成酶(TS)基因，发现了这mRAN水平的增高.突变的RAS原癌基因的mRNA分 析(见参考文献25综术述)在癌症的诊断或预测方面具有诊断价值。mRNA分析比常规的 DNA基因组分析有优越之处。由于没有内含子序列干扰mRNA的扩增，因此可以仅用一 组引物就能够扩增H-，K-，和N-RAS三个mRNA序列(E.S.K，未发表)。这样便可以比较 容易地检测出第12、13和61密码的突变，这些突变被认为是发生癌的原因。
⑶癌症诱因的检测
在下面将列举数个RNA/PCR扩增方法的主要应用。首先是对鼠鸟氨酸氨甲栈基转 移酶mRNA进行亚克隆来确定缺失点突变的位置。同样，该方法可用于检测哺乳动物细 胞mRNA转录后的剪接，研究与HLA疾病相关性因素，分析人HPRT突变，研究自身免疫 与T细胞受体序列之间的关系，分析人碱性磷酸脂酶的突变，研究土拨鼠肝炎病毒引 发的c-myc活性，确定刺桐丁蛋白4.1mRNA的剪接变异，等等。
根据已发表的序列合成扩增mRNA的引物，我们发现用RNA/PCR是获取cDNA的最简 便的方法。用在5'末端带有限制性内切酶位点的引物来扩增mRNA的一部分或全部编码区域。扩增后，PCR产物经合适的酶切并与适于表达的载体连接或制备成探针。按此方法可在一星期内完成从RNA样品到用于高效表达的修饰cDNA克隆.这比常规的合成/筛选cDNA库，亚克隆靶cDNA，为达到表达目的而对克隆进行诱变等过程要简单得多。区别主要在于用于扩增和分离cDNA克隆的引物为简并引物。引物序列是根据氨基酸的序列而定的，因此当只知道很少的蛋白质序列时，就有可能扩增特异的RNA分子。当只知一个内部序列时，只用一个基因特异性寡核苷酸引物，也可用PCR从稀有mRNA中分离出cDNA。扩增cDNA的分析因使用本书其它章切有关PCR产物的直接序列分析步骤 而变得简单。将噬菌体(T7)启动了作为PCR引物的一部分同样可用于序列分析，因为 PCR终产物中有大量的群体特异的产物。
上一篇：酶联免疫吸附试验 下一篇：实时PCR/RT-PCR解决方案
|
