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附录C 使用一步法RT-PCR从单一细胞中检测基因
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发布时间：2007-06-13
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方法：
分离单一细胞
在去除了细胞培养基后，COS-7细胞用不含钙镁的DPBS（0.20g/L KCl, 0.20g/L KH2PO4, 8.00g/L NaCl, 2.16g/L Na2HPO4·7H2O）清洗一次。加入Trypsin-EDTA(0.25% tryspsin,1mM EDTA·4Na)到细胞中（3ml/75cm2培养瓶）并保温至最多5分钟。加入20ml生长培养基以终止胰蛋白酶的活性。离心收集细胞。将细胞悬浮到DPBS中至大约1000个细胞/ml。取10μl悬浮液（大约10个细胞）点到清洁的盖玻片表面。用微量移液管在相差显微镜（Nikon Diaphot倒置显微镜，200倍放大）下收集细胞。分离的细胞（在少于1μl的DPBS中）转移到0.2ml薄壁PCR管中。
图1. 在显微镜下分离单个细胞
一步法RT-PCR
使用INVITROGEN的SUPERSCRIPT™ One-Step RT-PCR with PLATINUM® Taq System进行RT-PCR。
图2. 源自COS-7细胞的一步法RT-PCR产物。
1-3泳道分别是从1个，2个和5个细胞中扩增的人类肌动蛋白，使用的是有意义引物（CCT CGC CTT TGC CGA TCC）和反义引物（GGA TCT TCA TGA GGT AGT CAG TC）。C泳道则是没有加入反转录酶的扩增结果。
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