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第六章 增加PCR灵敏度
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发布时间：2007-06-19
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模板质量
模板的质量会影响产量。DNA样品中发现有多种污染物会抑制PCR。一些在标准基因组DNA制备中使用的试剂，如SDS，在浓度低至0.01％时就会抑制扩增反应。分离基因组DNA较新的方法包括了DNAZol，一种胍去垢剂裂解液，以及FTA Gene Guard System，其可以同基质结合，在血液及其他生物样品中纯化贮存DNA（表8）。
表8. 基因组DNA分离方法
Method Description
Proteinase K/phenol extraction Classic method
DNAzol® Reagents Fast, phenol-free DNA isolation
模板浓度
起始模板的量对于获得高产量很重要。对大多数扩增满意，104到106个起始目的分子就足以在溴化乙锭染色胶上观察到。所需的最佳模板量取决于基因组的大小（表9）。举例说，100ng到1μg的人类基因组DNA，相当于3×104到3×105个分子，对于足以检测到单拷贝基因的PCR产物。质粒DNA比较小，因此加入到PCR中的DNA的量是pg级的。
表9. 基因组大小和分子数目的比例
Genonic DNA Size(bp)* Target Molecules/µg of Genomic DNA Amount of DNA(µg) for -10^5 Molecules
E. coli 4.7×10^6 1.8×10^8 0.001
Saccharomyces cerevisiae 2.0×10^7 4.5×10^7 0.01
Arabidopsis thaliana 7.0×10^7 1.3×10^7 0.01
Drosophila melanogaster 1.6×10^8 6.6×10^5 0.5
Homo sapiens 2.8×10^9 3.2×10^5 1.0
Xenopus laevis 2.9×10^9 3.1×10^5 1.0
1.0Mus musculus 3.3×10^9 2.7×10^5 1.0
Zea mays 1.5×10^10 6.0×10^4 2.0
pUC 18 plasmid DNA 2.69×10^3 3.4×10^11 1×10^(-6)
*Haploid genome size
酶的选择
除了使用高质量模板DNA，聚合酶的选择也会影响产量（见第十三章，PCR聚合酶的比较）。Platinum聚合酶比其他聚合酶产量高，因为它防止了PCR反应配制过程中的非特异性扩增（图24）。对长片段（最大到12kb）的高灵敏度PCR，应选择酶混合物，最好是Platinum形式，如Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity。这种酶结合了Platinum技术和酶混合物（Taq DNA聚合酶同带有校正功能的聚合酶混合物）的优点。
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