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RNA的电泳，转膜和杂交
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发布时间：2007-10-22
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实验原理：基本同Southern Blotting，但因RNA是单链分子，必须消除局部区域形成的二级结构，在电场中泳动的距离才能反映它本身的大小，因而需使用变性胶进行电泳；操作过程中应特别注意防止RNA的降解。
实验材料：经检测质量好的RNA样品
实验步骤：
1.制胶：
Agarose 1%-1.2%，1×MOPS buffer。
用灭菌的DEPC水定容，加热融化，冷却至70℃加甲醛，使终浓度为2%，通风橱中放1hr。
2.准备电泳液：1×MOPS buffer（小号槽约配500ml，中号槽约配900ml）
3.制样：测好浓度后按以下体系加样
15 mg RNA + 灭菌的DEPC水 10 ml
Sample buffer 8 ml
loading buffer 2 ml
EB (10mg/ml,专用于RNA) 0.03 ml
65℃水浴变性10 min，立即放冰上，直至点样
4.点样：点样要仔细，不要漏出，并记录点样顺序。
5.电泳：中号槽: 电压100V电泳1hr左右，至溴酚兰离点样孔约3.5-4cm（凝胶在紫外灯下可看到28S和18S刚好分开即可）
6.转膜：转膜液用500ml 4×SSC加27ml 37%甲醛（终浓度为2%）；转膜步骤同Southern。注意加溶液后一切操作均在通风橱内进行，以避免甲醛对人体的伤害
7.照相：将胶及膜取下，分别在凝胶成像系统下看胶上RNA是否有残留，膜上RNA效果是否完好。
8.风干：在超净工作台上吹干。
9.固定：于紫外交联仪内以1200 ENERGY照一次约半分钟，再重复一次，再在超净工作台上吹干。
10.杂交：在杂交管内加约50ml杂交液，将膜卷起放入，注意RNA面朝内,于64℃预杂交1-4hr
11.探针准备：预先挖胶回收的PCR产物或酶切产物（better），测浓度，跑胶验证后，按以下体系加入
DNA 3 ml（约200ng）
ddH2O 10 ml
DNTP（1.67mM） 4 ml
杂交Buffer 10 ml
Klenow Fragment 2 ml
α-dCTP* 5 ml
先加入DNA 和 ddH2O,100℃变性10min，冰上放5min，再加入DNTP和杂交 primer，加酶时注意低温操作，先加在管壁上，立即到同位素室加同位素，混匀离心，于室温下反应半小时。
12.探针纯化：在原反应体系中继续加入
ddH2O 66 ml
NaAc 10 ml
无水乙醇 250 ml
混匀离心12000rpm 5min，倒去上清后加500 ml无水乙醇洗,离心 2 min，12000 rpm，倒去上清，检测信号，达103-104较好，加40 ml ddH2O和400 ml杂交液之后混匀离心，于100℃变性10min，冰上放置5min
13.13探针：取出杂交管倒去杂交液，加入15ml杂交液，将探针加入,盖紧，于64℃杂交过夜
14. 洗膜，压片：将杂交管中液体倒出，先加少量洗膜液Ⅰ，冷洗5min，倒出，再多加些洗膜液Ⅰ，冷洗10min，将膜取出测信号，根据信号大小决定是否热洗，若信号高，用洗膜液Ⅱ，Ⅲ继续洗，直到信号值达到适宜值为止，即膜上某一区域信号强，而其他区域信号弱代表杂交上了，然后包膜压片，放于-20℃或- 80℃3天左右即可洗X片。
15.结果观察与分析
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