一、实验目的

学习RNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术。

二、实验原理

RNA可以使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。在非变性电泳中，可以分离混合物中不同分子量的RNA分子，凡是无法确定分子量。只有在变性情况下，RNA分子完全伸展，其泳动率才与分子量成正比。

判断RNA提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的电泳图谱应可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三条带，且28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍。（图42—1）

三、材料、试剂及器具

1、  材料

总RNA提取物。

2、  试剂

（1）0.1%DEPC水：200ml双蒸去离子水加0.2mlDEPC焦炭酸、二乙酯混匀，室温放置过夜，高压灭菌。

（2）10x电泳缓冲液。

吗啉代丙烷磺酸（MOPS）        0.4mol/L（pH 7.0）

NaAc                           0.1mol/L

乙二胺四乙酸(EDTA)             10mmol/L

（3）50mL变性琼脂糖凝胶（1%）

（4）10x电泳缓冲液     5 mL

琼脂糖                0.5 g

0.1%DEPC水          36.5 mL

加热溶解，稍冷却，加入8.5 mL 37%甲醛。 

 （5）上样缓冲液：50%甘油，1mmmol/LEDTA，0.4% 溴酚兰，0.4%二甲苯蓝。

 （6）甲酰胺（去离子）。

3、器具

（1）电泳系统

（2）紫外透视仪

四、操作步骤

1、  将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。

2、  制胶：

称取0.5g琼脂糖粉末，加入放有36.5mL的DEPC水的锥形瓶中，加热使琼脂糖完全溶解。稍冷却后加入5mL的10x电泳缓冲液、8.5mL的甲醛。然后在胶槽中灌制凝胶，插好梳子，水平放置待凝固后使用。

3、  加样：

在一个洁净的小离心管中混合以下试剂：电泳缓冲液（10x）2μl、甲醛3.5mL、甲酰胺10mL、RNA样品3.5μl。混匀，置60℃保温10min，冰上速冷。加入3μl的上样缓冲液混匀，取适量加样于凝胶点样孔内。同时点RNA标准样品。

4、  电泳：

打开电泳仪，稳压7.5V/cm电泳。

5、  电泳结束后通过紫外透视仪观察。

五、注意事项

本实验中必须保持RNase污染以免RNA降解。所有试剂用DEPC水配制，用具也用DEPC水冲洗，并灭菌。

 六、实验结果

七、实验报告

记录所观察的电泳图谱，注意每条带的相对位置及浓淡等。分析解释实验结果。

八、思考题

如何判断RNA提取物的质量？