一、 组织和细胞总RNA提取：

异硫氰酸胍法

（一）试剂准备

1．CSB缓冲液：42mM柠檬酸钠；0.83% N-lauryl sarcosine(十二烷基，N甲基甘氨酸钠)；0.2 mM β-巯基乙醇。

2．变性液：异硫氰酸胍（终浓度 4 M）25g、CSB缓冲液 33ml，混合直至完全溶解，可在65℃助溶。4℃保存备用。

3．2 M乙酸钠：pH 4.0。

4．异丙醇

5．无水乙醇、70%乙醇

6．酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）

7．DEPC H2O：100ml ddH2O中，加入DEPC 0.1ml，弃分振荡，37℃孵育过夜。15磅高压灭茵，4℃保存备用。

（二）操作步骤

1．样品处理

（１）培养细胞：收集细胞1-2×107，离心，500g×5min。对于贴壁培养细胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后，PBS重悬细胞并转移至10ml离心管中；悬浮培养细胞可直接转移离心管；离心：500g×5min；PBS洗涤2次。弃上清，置冰浴。加预冷变性液2 ml，充分摇动，使细胞裂解完全。以下操作均在冰浴中进行。、

（２）组织：取1-2g组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置组织匀浆器中，加入预冷的变性液12ml，在冰浴中充分匀浆。

2．加2 M乙酸钠(pH 4.0)0.2ml，混合后将溶液转移至5ml离心管中。

3．加酚：氯仿：异戊醇2.2ml，颠倒混合用力振荡10s，冰上放置10min。

4．4℃离心，12000g×20min。

5．小心吸取上层含有RNA的水相，并转移至一新的5ml离心管中。避免吸取两相之间的蛋白物质。

6．加等体积的异丙醇，置-20℃至少30min，沉淀RNA。

7．4℃离心，12000g×15min。

8．弃上清，再加变性液2ml重悬RNA沉淀物，振荡直至RNA完全溶解（必要时可65℃水浴促溶）。

9. 加入等体积异丙醇，置-20℃ 30min。

10. 4℃离心，12000g×15min。

11. 弃上清，加入70%乙醇4ml洗涤RNA沉淀。4℃离心，8000g×5min。

12. 弃上清，将沉淀晾干。

13. 加入适量DEPC H2O溶液解RNA（65℃促溶10-15min）。

（三）注意事项：

1．所有实验过程均须避免Rnase的污染。

2．要避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。

TRIzol法

TRIzol RNA提取试剂盒是由GIBCO BRL公司推出专供提取RNA的产品，其操作方便、快捷。

（一）试剂准备

1． TRIzol试剂。

2．氯仿

3．异丙醇

4．75%乙醇（DEPC H2O配制）

5．DEPC H2O

（二）操作步骤

1． 样品处理：

（１）培养细胞：收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。

（２）组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置５min。

2．加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。

3．4℃离心，12000g×15min，取上清。

4．加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。

5．4℃离心，12000g×10min，弃上清。

6．加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。

7.  晾干，加入适量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10-15min）。

（三）注意事项

1．   样品量和Trizol的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的制不完全，导致RNA降解。

2．   实验过程必须严格防止RNsae的污染。

二、总RNA定量

RNA定量方法与DNA定量相似。RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/ml的单链RNA。如用1cm光径，用 ddH2O稀释DNA样品n倍并以ddH2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：

RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000

RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNA有降解。