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Which housekeeping genes for qRT-PCR control?-Real-Time
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日期：2007-06-20 07:56:09
点击：114 评论：0
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| Hi, I am wondering about the choice of housekeeping genes for my assay. If the gene of interest is a nuclear gene, is it better/ worse to use a mitochondrial gene as a housekeeping one. Are there any major pros/cons of the most popular housekeeping g |
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第一章 PCR和RT-PCR基础
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日期：2007-06-19 08:43:59
点击：144 评论：0
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| PCR基础 聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。这是一个指数增长的过程，因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。一般，经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染 |
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第二章 增加RT-PCR灵敏度
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日期：2007-06-19 08:42:14
点击：128 评论：0
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| 分离高质量RNA 成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。Trizol试剂法（见 下图 ）将一步法加 |
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第三章 增加RT-PCR特异性
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日期：2007-06-19 08:41:07
点击：104 评论：0
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| 起始cDNA合成 第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。 随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5'末端序列及从带有二级结构区 |
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第四章 RT-PCR应用
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日期：2007-06-19 08:39:11
点击：178 评论：0
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| 5' 和3' RACE RACE（cDNA末端快速扩增，Rapid Ampliphication of cDNA Ends）是一种获得转录本5'或3'未知序列的方法。不象普通RT-PCR那样使用两个序列特异性的引物，RACE使用一个序列特异性的引物和或者mRNA的poly(A)尾（3' RACE）或者加到cDNA末端的多聚同聚体（5' RA |
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第五章 增加PCR特异性
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日期：2007-06-19 08:33:24
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| 引物设计 细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点： * 典型的引物18到24个核苷长。引物需要 |
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第六章 增加PCR灵敏度
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日期：2007-06-19 08:31:11
点击：68 评论：0
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| 模板质量 模板的质量会影响产量。DNA样品中发现有多种污染物会抑制PCR。一些在标准基因组DNA制备中使用的试剂，如SDS，在浓度低至0.01％时就会抑制扩增反应。分离基因组DNA较新的方法包括了DNAZol，一种胍去垢剂裂解液，以及FTA Gene Guard System，其可以同基质结合， |
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第七章 提高忠实性
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日期：2007-06-19 08:29:55
点击：72 评论：0
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| 带有校正功能的酶 包括克隆和效率分析，PCR产物表达或定点突变在内的PCR应用都需要高忠实性的PCR。Taq DNA聚合酶被看做是低忠实性的聚合酶，因为其缺少3'到5'外切核酸酶（校正）活性。使用带有3'到5'外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高忠实性。但是这些聚合酶的产量 |
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第八章 其他需要考虑的事情
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日期：2007-06-19 08:28:48
点击：67 评论：0
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| 扩增长目的片段 当扩增大于5kb的目的片段时，可以使用用于超长PCR的酶或酶混合物以获得最佳产量（参见 第十三章 ，PCR聚合酶的比较和 图24 ）。Taq DNA聚合酶并不能有效扩增较长目的片段（大于5kb），可能是因为其缺少3'-5'外切核酸酶活性，不能纠正dNTP错误掺入。错误 |
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第九章 PCR应用
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日期：2007-06-19 08:27:12
点击：89 评论：0
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| 多重PCR 在多重PCR中，同时使用多对引物扩增几个不同的位点。这种复杂的PCR一般会导致低产量，而且需要高浓度的Mg2+。如果没有正确优化，容易出现假阳性。Platinum Taq DNA聚合酶经改良，可以适应广谱浓度的Mg2+，从而提高多组反应成功的可能性（ 图27 ）。 图27. 对于 |
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第十章 PCR产物克隆
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日期：2007-06-19 08:24:29
点击：208 评论：0
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| PCR克隆主要有TA克隆法, 限制性酶切与连接法，杂交法和近期开发出来的特异性重组法等。 但因为TA克隆法操作最简单，快速和高效的原因，成为Taq聚合酶PCR产物的最佳克隆方法。TA克隆法由Invitrogen发明，并拥有全球TA Cloning商标的专利权。 TA克隆方法（Original TA Cl |
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第十一章 PCR扩增产物表达的快速方法
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日期：2007-06-19 08:23:38
点击：74 评论：0
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| 使用Directional TOPO表达试剂盒把克隆基因转入到表达载体，将节省你大量时间。这些试剂盒具有快速，高效的特点，Directional TOPO克隆技术结合高效的pET和pcDNA3.1载体中，使你从PCR中立即得到表达结果。 成熟的技术 Directional TOPO克隆技术将平整末端的单向克隆的PC |
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第十二章 疑难解答
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日期：2007-06-19 08:20:15
点击：73 评论：0
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| 第十二章 疑难解答 问 题 可能原因 建议解决方法 RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物 RNA被降解 在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA 使用良好的无污染技术分离RNA 在将组织从动物体取出后立刻处理 在100％甲酰胺中储存RNA如果使用胎盘RNa |
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第十三章 相关产品
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日期：2007-06-19 08:18:26
点击：74 评论：0
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| 第十三章 相关产品 PCR聚合酶的比较 产 品 产物长度 产 量 特异性 忠实性 Taq DNA Polymerase ＜5kb ● ● ● Taq PCRx DNA Polymerase ＜5kb ● ●* ● PCR SuperMix ＜5kb ● ● ● Platinum Taq DNA Polymerase ＜5kb ●● ●● ● Platinum Taq PCRx DNA Polymeras |
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附录A 引物序列精选
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日期：2007-06-19 08:17:18
点击：134 评论：0
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| RT-PCR引物序列 基 因 来源 引 物 序 列 产物大小（kb） β-actin 人 有意义链 反义链 CCTCG CCTTT GCCGA TCC GGATC TTCAT GAGGT AGTCA GTC 0.62 β-actin* 大鼠 有意义链 反义链 TACAA CCTCC TTGCA GCTCC GGATC TTCAT GAGGT AGTCA GTC 0.62 β-actin 小鼠 有意义链 反 |
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