一 目的要求：
　　通过本实验的学习，复习巩固免疫化学的基本知识，并熟练掌握免疫扩散法的操作步骤，掌握其在抗血清效价的测定和特异性抗体的分析中的应用。


二 实验原理：
　　在电场作用下，抗原在含定量抗体的离子琼脂中泳动后，如二者比例合适时，可在短时间内出现锥形的沉淀峰，形似火箭状，故又称为火箭电流。此沉淀峰的高度与抗原的浓度成正比，与抗体的浓度成反比。单向琼脂免疫电泳技术常用于捡测标本中的免疫球蛋白含量。


三 实验材料：


1．材料和试剂
（1）PH8.6，0.1M巴比妥——巴比妥钠缓冲液
　　巴比妥钠 10.3 g
　　巴比妥 1.84 g
　　硫柳汞 100 mg（防腐剂）
　　蒸馏水加热溶解并定容至500ml
（2）1%预复琼脂（或琼脂糖）
　　1g琼脂（或琼脂糖）加蒸馏水100ml溶化即可。
（3）1.5%琼脂糖凝胶
　　1.5g琼脂糖加50ml蒸馏水置水溶中煮沸溶解或用与波炉加热溶解（注意不要溢出且注意加入蒸发的水），然后再加入50ml上述巴比妥缓冲液混匀，置4℃保存备用。
（4）抗原及相应免疫血清。


2．设备和器材
玻璃板、模具，打孔器和挑针、滴管、有盖搪瓷盒（内铺有湿润的滤纸）、温箱（25℃）、三角烧杯、玻璃搅拌、微量加样器、其他常用器材。


四 操作步骤：


1．抗原、抗体浓度的选择
　　以分别固定抗原含量与抗体浓度的方法，选取最小抗原量与最低抗体浓度，在免疫电泳后能出现最清晰项端狭窄且尖的锥形沉淀峰，长达2～5cm者为标准。一般抗原用量为0.5～5微克，抗血清用量为5～10微升，稀释度于1：10～1：200之间进行选择。
2．预复琼脂玻板的制备
　　将溶化的1%预复琼脂用滴管加玻板上，使之能将表面覆盖即可，放于温箱内干燥（或自然干燥），即可用以制备凝胶板。
3．抗血清琼脂板制备
　　根据上述选择结果，取一定量抗血清与一定量融化并冷却至56℃的1.5％巴比妥缓冲琼脂混合，使抗血清的浓度为以上述方法选择出的最适浓度，浇制抗血清琼脂板。琼脂厚度为1～2mm，玻板大小可根据实验所需而确定。如用5×7.5cm大小玻板时，约需抗血清琼脂6ml。
4．打孔、加样
　　待琼脂凝固后，于距玻板一长边10mm处，以3mm孔径打孔器打孔一排，孔距5mm。于各孔中加入抗原液，每孔10微升。每次实验中应加入几个不同浓度的标准抗原以作对照。稀释范围包括标本含量的最高与最低水平。
5．电泳
　　将琼脂板置于电泳槽横梁上，加样端位于负极，以双层滤纸联接琼脂板与电泳槽内缓冲液（槽内缓冲液为0.06M pH8.6巴比妥缓冲液）。接通电源，板端电压3v／cm，电流强度3mA/cm，电泳5小时。
6．结果判定（电泳结果示意图点击展开）
　　电泳毕，取出琼脂板，依次用生理盐水、蒸馏水浸泡后，加1％鞣酸冲洗琼脂板，晾干，即可观察与测定结果。也可以常规蛋白质染色法染色后观测结果。测定结果的方法有两种：一是测量沉淀峰的高度（自孔中央至峰尖），以mm计；另一是以求积仪测量沉淀峰的面积，以mm2计。前者较简便，后者较准确。根据测定的结果，从标准曲线中计算出待检标本中的抗原含量。
7．标准曲线制定
　　用上述选择好的最适浓度抗血清制备琼脂板。打孔，加入合适比例的5～10个标准抗原浓度，反复试验10次，取每次电泳后所测定的沉淀峰高度（或面积）的平均值，绘出标准曲线。
8．标本的保存（点击展开）


实验中注意事项（点击展开）


五 讨论：
1．对实验结果的分析
2．实验的体会和建议