1．了解凋亡细胞的生化特征。

2．学会制作DNAladder的一种方法。

　　随着对凋亡机制研究的深入，更多凋亡细胞的生化特征被发现(见第1部分第7章调亡细胞的识别)。但对凋亡细胞的生化特征发现最早、最明显的特征被称为DNA ladder(梯状电泳带)。由于大多数程序性死亡的细胞中(也发现少量凋亡细胞中，这个生化特征不明显)，内源性核酸内切酶活化，核DNA随机在核小体的连接部位被打断，成为寡聚核小体，若对核DNA进行琼脂糖凝胶电泳，可显示以180-200bp为基数的DNAladder特征；相比之下，正常细胞的DNA不降解，电泳条带表现为一大分于片段；坏死细胞的DNA虽然也存在降解，但由于存在各种长度的DNA片段，无法形成梯状带纹，表现为连续分布的弥散条带。

　　提取细胞中的DNA，可用传统的蛋白酶K消化和酚、氯仿、异戊醇抽提的方法，也可以用其他方法。本实验提取细胞中DNA的方法是：利用在高盐离子浓度时DNA溶解度降低被析出，而在低盐离子浓度时DNA易被溶解的特性来纯化并提取DNA。首先用一种变性溶液(溶液A)使膜蛋白变性，从而使DNA从破碎的膜中释放出来，再加人一种高盐离子浓度的溶液(溶液B)和一种树脂(溶液C)，溶液B的作用是使DNA从溶液中析出并终止溶液A的作用，析出的DNA被吸附到溶液C上，继后用洗涤液(溶液D)洗去杂质后，再加人低盐离子浓度的溶液(溶液E)，则DNA从溶液C上被洗脱下来，溶解于溶液E中。

　　利用上述方法提取正常、凋亡和坏死细胞核中的DNA，进行DNA琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下可观察和拍照3种细胞的DNA电泳条带。

***仪器：    微量加样器，恒温水浴锅，高速离心机，电泳仪和电泳槽，暗箱式紫外透射仪，微量离心管，吸头。

***材料：   HL—60细胞，动物基因组DNA提取试剂盒(购自北京鼎国生物技术发展中心，内含溶液A、B、C、D和E等，其中溶液D在使用前以1：1加入无水乙醇)。

***试剂： 5XTBE，6XDNA加样缓冲液，1％琼脂糖，溴化乙啶溶液(EB)。

(一)提取细胞DNA

1。将上面实验留下的3瓶细胞，按原实验分组的顺序，分别作为①对照组；②加药组(内有大量凋亡细胞，也有一些正常和坏死细胞)；③坏死组(可通过高温或微波处理使细胞坏死)。

2．将3瓶细胞离心(1$00r／rain、5min)收集后分别移入3个1．5 mi．微量离心管中，以下的步骤3个样品同样操作。

3．加入300flL溶液A(使蛋白变性)，用微量加样器轻缓吹打使之变成清亮的溶液，室沮放置5raino

4．加入800pL溶液B和25pL溶液C(树脂，用前混匀)，用微量加样器轻缓吹打使之混匀，室沮放置20min。这一步作用是使DNA从溶液中析出并被吸附到树脂上。

5．至少8000r／rain离心5min，弃上清。

6．加人400pL溶液B，用微量加样器轻缓吹打使之混匀，至少8000r／rain离心5rain，弃上清。此步骤欲再次提高盐浓度，使DNA与树脂结合更紧密。

7．加入500flL溶液D(用于洗杂质，用前1：1加入无水乙醇)，轻缓吹打使之混匀，至少8000r／rain离心30～60 s，弃上清。

8．重复步骤7。

9．至少12000r／min离心30-60 8，吸干上清，室沮晾干约10millo

10．加入50-100pL溶液E，混匀后置40-$OqC水浴，1-5mino

11．至少12000r／min离心30-60 8，取上清液，即为DNA，4℃保存(若长期使用，需放于—20℃)。

(二)琼脂糖凝胶电泳

1．配制凝胶和胶板制备

(1)配制所需的电泳缓冲液(通常为0．5XTBE)。

(2)用橡皮膏封住(注意封严!)电泳凝胶床的两端开口，形成一个胶模，插好梳子后平放于工作台上。

(3)在锥形瓶中根据需要加入一定量0．5XTBE电泳缓冲液，加入使终浓度为1％的琼脂糖粉，瓶口盖上锡箔纸，在水浴或微波炉上加热至琼脂糖完全溶解。

(4)溶液冷却至60℃时，加入EB(注意带手套操作!)至终浓度为0．5μg/mL，充分混匀。

(5)将温热的琼脂糖溶液倒人胶模中，凝胶的厚度在3-5 mm圆之间。检查是否有气泡，若有可用吸管小心除去，静置凝胶。

(6)凝胶完全凝固后(应为浅乳白色)，通常需要在室沮中放置30-45min，除去橡皮膏，将装有凝胶的电泳凝胶床放人电泳槽。也可同时制作几块凝胶，待其固化后用保鲜纸包住以防水分挥发，置4℃保存，通常在数日之内可以使用。

(7)加入恰好没过胶面约1-2mm：的0．5XTBE电泳缓冲液，移去梳子，即可见形成

的加样孔。

2．加样

10LDNA加入2PL加样缓冲液，每孔点样10Pl(记录点样顺序)。使用加样缓冲液目的：①增大样品密度，确保DNA均匀进入样品孔内；②使样品呈现颜色，利于加样操作；③含有电场中向阳极泳动的染料，可掌握速率。

3．电泳

盖上电泳槽并通电，使DNA向阳极移动(电泳过程中，EB向阴极移动，与DNA相反)采用1-5V／cra的电压降(按两极间距离计算)，可在室沮下电泳，若气温太高，需在电泳槽周围放置冰块，电泳至澳酚蓝(凝胶中呈蓝紫色)和二甲苯青(凝胶中呈蓝色)迁移到距凝胶前沿1-2cm处停止电泳(约30-45mia)。

4．观察和摄影

切断电源，从电泳槽中取出电泳凝胶床，将凝胶置于紫外透射仪下观察电泳结果，如有必要可进行拍照。

（点击下面的链接查看图片,如果你禁止了弹出窗口,你将无法看到结果图片或视频!）

1．画出你观察到的凋亡、坏死及正常细胞的DNA琼脂糖凝胶电泳图谱。

2．列出你实验中所用的电泳条件。

1．操作要温和，防止大分子DNA被打断，影响实验结果。

2．若细胞较多，要适当加大溶液A(蛋白变性剂)和溶液C(吸附DNA的树脂)的用量。

3．根据实验的具体情况，对琼脂糖浓度、梳子类型、上样量、电泳条件如电泳所加电压和电泳时间等要进行预实验，使能明显区分出3种细胞的条带，特别是凋亡细胞的梯状电泳带。本实验给出了参考值，可根据实际条件进行调整。

4．EB可嵌入双链核酸中，是一种诱变剂，操作时要戴手套，如果粘到手上，要及时用大量清水冲洗。

1．试述凋亡细胞的生化特征。

2．试述本实验中溶液A、B、C、D、E在提取DNA中的作用。