缓冲液是一种能在加入少量酸或碱时抵抗pH改变的溶液。PH缓冲系统对维持生物的正常pH值，正常生理环境起重要作用。多数细胞仅能在很窄的pH范围内进行活动，而且需要有缓冲体系来抵抗在代谢过程中出现的pH变化。在生物体中有三种主要的pH缓冲体系，它们时蛋白质、重碳酸盐缓冲体系。每种缓冲体系所占的分量在各类细胞和器官中是不同的。
在生化研究工作中，常常要用到缓冲溶液来维持实验体系的酸碱度。研究工作的溶液体系pH值的变化往往直接影响到我们工作的成效。如果提取酶实验体系的pH值变化或变化过大，会使酶活性下降甚至完全失活。所以我们要学会配制缓冲溶液。
由弱酸及其盐组合一起使具有缓冲作用。生化实验室常常用的缓冲系主要有磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tiris（三羟甲基氨基甲烷）等系统，在生化实验或研究工作中要慎重地选择缓冲体系，因为有时影响实验结果的因素并不是缓冲液的pH值，而是缓冲液中的某种离子。如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和三羟甲基甲烷等缓冲剂都可能产生不需要的反应。
硼酸盐：硼酸盐与许多化合物形成复盐、如蔗糖。
柠檬酸盐：柠檬酸盐离子容易与钙结合，所以存在有钙离子的情况下不能使用。
磷酸盐：在有些实验，它是酶的抑止剂或甚至是一个代谢物，重金属易以磷酸盐的形式从溶液中沉淀出来。而且它在pH7.5以上时缓冲能力很小。
三羟甲基氨基甲烷：它可以和重金属一起作用，但在有些系统中也起抑止的作用。其主要缺点时温度效应。这点往往被忽视，在室温pH是7.8的Tris一缓冲液，在4℃时是8.4，在37℃时是7.4，因此，4℃配制的缓冲液拿到37℃测量时，其氢离子浓度就增加了10倍。而且它在pH7.5以下，缓冲能力很差。
缓冲液的pH值由哪些因素决定？
设缓冲系统的弱酸的电离常数为K（平衡常数），平衡时弱酸的浓度为[酸]，弱酸盐的浓度为[盐]，则由弱酸的电离平衡式可得下式：
根据此式可得出下列几点结论：
（1）缓冲液的pH值与该酸的电离平衡常数K及盐和酸的浓度有关。弱酸一定，但酸和盐的比例不同时，可以得到不同的pH值。当酸和盐浓度相等时，溶液的pH值与PK值相同。
（2）酸和盐浓度等比例也增减时，溶液的pH值不便。
（3）酸和盐浓度相等时，缓冲液的缓冲效率为最高，比例相差越大，缓冲效率越低，一般地说缓冲液有效缓冲范围为PK±1pH。
从上述可知，只要知道缓冲对的PK值，和要配制的缓冲液的pH值（及要求的缓冲液总浓度）时，可按公式计算出[盐]和[酸]的量。这样算涉及到对数的换算，较麻烦，前人为减少后人的计算麻烦，经计算已为我们总结出pH值与缓冲液对离子用量的关系列出了表格。讲义附录部分节录有磷酸缓冲液的配制表。只要我们知道要配制的缓冲液的pH，经查表便可计算处所用缓冲剂的比例和用量。例如配制500nmpH5.8浓度为0.1M磷酸缓冲液。
经查表知pH5.8浓度为0.2M Na2HPO48.0毫升，而0.2M Na2HPO492.0毫升。依此可推论出配制100ml0.1M的磷酸缓冲液需要0.1M Na2HPO48.0毫升，而0.1M Na2HPO4需要92.0毫升。
所以500ml 0.1M磷酸缓冲液需要Na2HPO4量为:
需Na2HPO4量为 :
计算好后，按计算结果称好药品，放于烧杯中，加少量蒸馏水溶解，转移入50ml容量瓶，加蒸馏水至刻度，摇匀，便得所需的缓冲液。
各种缓冲溶液的配制，均按下表按比例混合，某些试剂，必须标定配成准确的浓度才能进行，如醋酸、NaOH等。
（1）醋酸盐缓冲溶液
|
PH |
M/S
醋酸钠
(毫升数) |
M/S
醋酸
(毫升数) |
PH |
M/S
醋酸钠
(毫升数) |
M/S
醋酸
(毫升数) |
PH |
M/S
醋酸钠
(毫升数) |
M/S
醋酸
(毫升数) |
|
3.2 |
1 |
32 |
|
|
|
|
|
|
|
3.4 |
1 |
16 |
4.4 |
9.4 |
12.6 |
5.4 |
17.1 |
2.9 |
|
3.6 |
1.5 |
18.5 |
4.6 |
9.8 |
10.2 |
5.6 |
18.1 |
1.9 |
|
3.8 |
2.4 |
17.6 |
4.8 |
12.0 |
8.0 |
5.9 |
19 |
1 |
|
4.0 |
3.6 |
16.4 |
5.0 |
14.1 |
5.9 |
6.2 |
19.9 |
0.1 |
|
4.2 |
5.3 |
14.7 |
5.2 |
15.8 |
4.2 |
|
|
|
（2）磷酸盐缓冲液的配制
1/15M的Na2HPO4溶液（11.876克纯的Na2HPO4·2H2O溶于1升蒸馏水中）及1/15M的KH2PO4溶液（将9.078克KH2PO4溶于1升水中）将着两种溶液依不同比例混合。
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PH |
Na2HPO4
（ml） |
KH2PO4
（ml） |
PH |
Na2HPO4
（ml） |
KH2PO4
（ml） |
PH |
Na2HPO4
（ml） |
KH2PO4
（ml） |
|
4.94 |
0.1 |
9.90 |
6.46 |
4.00 |
6.00 |
7.73 |
9.00 |
1.00 |
|
5.29 |
0.25 |
9.75 |
6.81 |
5.00 |
5.00 |
8.04 |
9.50 |
0.50 |
|
5.39 |
0.50 |
9.50 |
6.98 |
6.00 |
4.00 |
8.34 |
9.75 |
0.25 |
|
5.91 |
1.00 |
9.00 |
7.17 |
7.00 |
3.00 |
8.69 |
9.90 |
0.10 |
|
6.24 |
2.00 |
8.00 |
7.38 |
8.00 |
2.00 |
9.18 |
10.00 |
0.00 |
|
6.47 |
3.00 |
7.00 |
|
|
|
|
|
|
(3)Tris缓冲溶液
贮备液
溶液A：0.2M Tris（三羟甲基氨基甲烷）
溶液B：0.2M HCl
50mlA＋XmlB，用蒸馏水稀释到200ml
|
pH |
X（ml） |
pH |
X（ml） |
|
7.2 |
44.2 |
8.2 |
21.9 |
|
7.4 |
41.4 |
8.4 |
16.5 |
|
7.6 |
38.4 |
8.6 |
12.2 |
|
7.8 |
32.5 |
8.8 |
8.1 |
|
8.0 |
26.8 |
9.0 |
5.0 |
（4）磷酸盐－柠檬酸缓冲液的配制
0.2M Na2HPO4·2H2O溶液及0.1M柠檬酸溶液，并依不同比例混合（见表）
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pH |
Na2HPO4
（ml） |
柠檬酸
（ml） |
pH |
Na2HPO4
（ml） |
柠檬酸
（ml） |
|
2.2 |
0.40 |
19.60 |
5.2 |
10.72 |
9.28 |
|
2.4 |
1.14 |
13.76 |
5.4 |
11.15 |
8.85 |
|
2.6 |
2.18 |
17.82 |
5.6 |
11.60 |
8.40 |
|
2.8 |
3.17 |
16.83 |
5.8 |
12.09 |
7.91 |
|
3.0 |
4.11 |
15.89 |
6.0 |
12.63 |
7.37 |
|
3.2 |
1.94 |
15.06 |
6.2 |
13.22 |
6.78 |
|
3.4 |
5.70 |
14.30 |
6.4 |
13.85 |
6.15 |
|
3.6 |
6.44 |
13.56 |
6.6 |
14.55 |
5.45 |
|
3.8 |
7.10 |
12.90 |
6.8 |
15.45 |
4.55 |
|
4.0 |
7.71 |
12.29 |
7.0 |
16.47 |
3.53 |
|
4.2 |
8.28 |
11.78 |
7.2 |
17.39 |
2.61 |
|
4.4 |
8.82 |
11.18 |
7.4 |
18.17 |
1.83 |
|
4.6 |
9.35 |
10.85 |
7.6 |
18.73 |
1.27 |
|
4.8 |
9.86 |
10.14 |
7.8 |
19.15 |
0.85 |
|
5.0 |
0.30 |
9.70 |
8.0 |
19.45 |
0.55 |
(5)盐缓冲液的配制
a、M/20硼砂（10.108克Na2B4O7·10H2O溶在一升水中）
b、M/5硼酸＋M/20NaCl（12.45克H2BO＋2.925克）NaCl在一升水中（见下表）
|
pH |
a(ml) |
b(ml) |
pH |
a(ml) |
b(ml) |
|
7.0 |
0.45 |
9.55 |
8.2 |
3.5 |
6.5 |
|
7.2 |
0.75 |
9.25 |
8.4 |
4.45 |
5.55 |
|
7.3 |
1.10 |
8.9 |
8.6 |
5.5 |
4.5 |
|
7.8 |
2.05 |
7.95 |
9.0 |
8.2 |
1.8 |
|
8.0 |
2.70 |
7.3 |
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|
(五)药品规格及其应用范围
根据药品纯度不同一般可分为下列几类：
（1）保证试剂 （G、R）用在科学研究及微量分析方面
（2）分析试剂 （A、R）定量分析时标定溶液用
（3）化学纯试剂（C、P）定性试验时用
（4）实验试剂 （L、R）用于和实验结果关系不大的场合
（5）工业品 用于大型或工业生产上
在实验中用的最多的是C、P一类，A、R使用较少，G、R非有特殊需要时，一般尽量用A、R来代替，因为纯度高，价格很贵。
除上述几种规格外尚有几种不以纯度分类的规格：
（1）生物试剂 （B、R）生物体中提炼出来，成分含量相差较大，如培养微生物时用牛肉膏，酵母膏等药品即属此类。
（2）指示剂（Ind）配制指示剂用
（3）层析纯，色层分析时采用
（4）生物染色剂BS如甲基兰
（6）常用标准溶液的配制与标定
(1)0.1mol/L NaOH溶液
1、配制方法：
1）氢氧化钠中含有碳酸钠，所以不能直接配成纯溶液，因碳酸钠几乎不溶于饱和的氢氧化钠溶液中，故可以先配成饱和的氢氧化钠溶液（约19mol/L）而将沉淀弃去。
另一个方法可加氯化钡110克溶于100ml水中配成饱和溶液，入瓶内密闭瓶塞，放置1－2天，使碳酸钠沉淀，取上层清夜6.3ml加入刚煮沸过冷却的蒸馏水750ml，可得浓度约为0.1N氢氧化钠溶液。
2）称氢氧化钠结晶5克（或干燥棒状，或小片状得氢氧化钠5克）置于4000ml烧杯中，加水300ml，使之溶解，加热并缓缓加入1mol/L氯化钡溶液 200ml。将碳酸钡沉淀后，将上层溶液倾入1000ml量筒中，加入刚煮沸冷却的蒸馏水，稀释至1000ml刻度处，放置使沉淀下沉，取其上清液。
NaCO3＋BaCl2→BaCO3＋2NaCl
2、标定
取分析纯的苯二酸氢钾（KHC8H4O4）置于称量瓶中，于烘箱内105－110℃下加热2小时，取出后放入干燥器内半小时，用倾出法在天平上称出约 0.45克，称准至小数点第四位，共称两份，分别放入150ml三角瓶中，各加入25ml溶解后再加入1％酚酞指示剂3－4滴，然后配制好的氢氧化钠溶液装入滴管中，滴定上述两种样品，其误差不得超过0.3％，否则重行标定，氢氧化钠浓度计算如下
式中：
W邻苯二酸氢钠…………………称取邻苯二酸钾的重量（克）
VNaOH……………………………滴定用去氢氧化钠毫升数
0.20442……………………………邻苯二酸氢钾的毫克当量。
（2）0.1mol/L硫代硫酸钠溶液：
1、配制方法：
称取硫代硫酸钠（Na2S2O3·5H2O）12.5克无水碳酸钠0.2克溶于煮沸后冷却的水中稀释到1000毫升，其浓度约为0.1mol/L，放置3－4天后才能进行标定。
2、标定：
取分析纯的碘酸钾置称量瓶中于烘箱中加热105－110℃两小时，移入干燥器内冷却，称出两份样品重量为0.07－0.08克（标准至小数四位）于 250ml三角瓶中，各溶于50ml水中，待完全溶解后，各加入30％碘化钾溶液10ml，12mol/L硫酸10ml，放置3分钟，稀释至150ml，用上述配制的硫代硫酸钠溶液滴定至草黄色，加入1％淀粉指示剂5ml继续滴定至兰色消失，记录硫代硫酸钠溶液的用量。
另取30％碘化钾溶液10ml，12mol/L硫酸10ml，加水至150ml加入淀粉指示剂5ml，用硫代硫酸钠滴定，作为空白试验：
硫代硫酸钠溶液计算如下：
WKIO3…………………称取碘酸钾的重量（克）
VNa2S2O3…………………滴定用去硫酸钠溶液的毫升数
VNa2S2O3…………………空白实验用去硫代硫酸钠溶液的毫升数。
214.2………………………KIO3的克分子量
6…………………………KIO3的当量
注：硫代硫酸钠溶液易被空气氧化，如溶液中有硫细菌时，也能使硫代硫酸钠分解，而光线使硫细菌生长，此外硫代硫酸钠亦能与CO2作用，所以此溶液在放置过程中浓度逐渐降低，所以此溶液应放置在棕色瓶中密闭瓶塞。所以每隔一定时间应重新标定一次。如发现溶液浑浊（析出硫磺）就不能再用。
（3）0.1mol/L高锰酸钾溶液
1、制备方法：
称取分析纯高锰酸钾3.2克入1000ml烧杯中，加400ml水加热溶解，然后稀释至一升，静置一周以上，用玻璃制成的虹吸管，吸取上层清液贮于棕色细口瓶中。
如为了缩短时间亦可用制备的溶液在接近沸腾温度下加热一小时，然后旋转过夜，次日用布氏漏斗或沙芯漏斗过滤。
2、标定：
称取分析纯草酸钠入称量瓶中，于烘箱中加热150℃1小时，然后正确称出0.25－0.30克两份于2个400ml烧杯中各加水100ml及12mol/L H2SO420ml，使之溶解，并加热至80℃，然后用高锰酸钾滴定，开始时滴定速度不宜过快，只能滴几滴，搅拌均匀待红色退去后，再以每分钟20－25滴速度进行滴定，直至溶液呈粉红色，数分钟不退为止，滴定后溶液温度不宜低于60℃。
（4）0.2mol/L碘液
1、制备方法：
碘在水中溶解度很小，不可能达到0.2mol/L，当溶液中有碘化钾存在时，碘和碘离子结合称为溶解度较大的才行。
称取碘6.5克于500ml烧杯中加入13克碘化钾及水15ml（水不可多加，否则碘不能溶解完全），不时搅拌待碘完全溶解后，加水稀释至500ml，移入棕色瓶中，密闭塞紧置于阴暗处3－4天后再行标定。
2、标定：
准确称出在105－110℃烘二小时的分析纯亚砷酸（AS2O2）0.200克（小心，有剧毒）两份于250ml三角瓶中，各加入6mol/L氢氧化钠5ml及水10ml，溶解后，再加6mol/L盐酸，用水稀释至总体积为100ml，再加入碳酸氢钠中和多余的酸，加1％淀粉指示剂5ml，然后用碘液滴定，其浓度计算如下：
WAS2O2…………………………称取亚砷酸的重量（克）
VI2…………………………………滴定用去碘液毫升数
0.04946…………………………亚砷酸的毫克当量
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