实验目的

(1)  了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用

    (2)  掌握质粒DNA分离、纯化的原理

    (3)  学习碱裂解法和煮沸法分离质粒DNA的方法

实验原理

    质粒（Plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子它是染色体外能够稳定遗传的因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主的进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生型的自主复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。目前，质粒已广泛的用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。

    遗传工程使用的质粒一般来自细菌，现在发现不仅原核生物，而且真核生物如酵母、天蓝色链霉菌等也存在质粒。在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2％左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内复制，一般分为两种类型：严密控制复制型和松弛控制复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。每个细胞中只含一个或几个质粒分子，通常大的质粒如F因子等拷贝数少，复制受到严格控制。松弛控制型复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如Col E1质粒及其衍生质粒，在每个细胞内约含有20多个拷贝。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素，已达到阻止染色体DNA合成而使细胞内没有蛋白质合成的情况下，由于有关复制所需要的蛋白质的缺少，染色体与严密型质粒的复制都随之停止，但松弛型质粒不受细菌这些复制蛋白的影响，如Col E1质粒或他的衍生质粒仍然继续复制12－16h，直到每个细胞中大约积累1000－2000个拷贝为止。此时质粒DNA含量甚至可达到细胞DNA总量的40－50％。

    性因子（F因子）、抗药因子（R因子）和大肠杆菌素因子等都是常见的质粒。对于带有抗药基因的Col E1衍生质粒，不仅能够大量制备，又便于检出。所以，这种质粒被广泛的使用。质粒pBR322就是Col E1的衍生质粒，它带有抗氨苄青霉素和抗四环素的基因，根据该质粒的抗药性，较容易检出和鉴定。以pBR322为基础，人工构建的pBR322系列质粒以及pUC系列质粒等都是遗传工程中常用的基因运载体。

    所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。

    质粒DNA分离纯化方法有多种，但其原理和步骤大同小异，本实验着重介绍两种常用的、快速、微量方法。

    1. 碱裂解法

    在EDTA存在的条件下，用溶菌酶破坏细菌细胞壁，同时经过NaOH和阴离子去污剂SDS处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体充分的裂解。此时，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞膜碎片上，离心时易被沉淀出来。而质粒DNA则留在上清液内，其中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量染色体DNA，实验中加入蛋白质水解酶和核糖核酸酶，可以使它们分解，通过碱性酚（pH8.0）和氯仿－异戊醇混合液的抽提可以除去蛋白质等等。异戊醇的作用是降低表面张力，可以减少抽提过程中产生的泡沫，并能使离心后水层、变性蛋白层和有机层维持稳定。含有质粒DNA的上清液用乙醇或异丙醇沉淀，获得质粒DNA。

    2. 煮沸法

    细胞经溶菌酶破壁后，用含有TritonX－100的缓冲液处理，溶解细胞膜。在高温条件下，使蛋白质变性。变性蛋白带着染色体DNA一起沉淀下来，质粒DNA仍留在上清液中。离心后的上清液再用异丙醇或乙醇处理，沉淀出质粒DNA。

    以上两种制备方法的实验过程中，由于细菌裂解后受到剪切力或核算降解酶的作用，染色体DNA容易被切断成为各种大小不同的碎片而与质粒DNA共同存在，因此，采用乙醇沉淀法得到的DNA除含有质粒DNA外，还可能有少部分染色体DNA和RNA，必要时可进一步纯化。

    在嵌合燃料存在的情况下，进行氯化铯密度梯度离心，线状的染色体DNA由于插入较多的染料分子而变的比重较轻，共价闭环质粒DNA插入的染料分子较少，比重较大，从而可以获得高纯度的质粒DNA。

    在细胞内，质粒以超螺旋的形式存在于细胞质内，这种DNA分子叫作共价闭环DNA，在一些条件下，如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，则另一条链就能自由旋转而使分子内的扭曲消除，形成松弛型的分子叫做开环DNA分子，本实验制备出的质粒为cccDNA，但由于较长时间的贮存或操作等原因，会形成部分ocDNA。

    本实验制得的质粒DNA经鉴定后可直接用于限制性内切酶降解、细菌转化以及体外重组试验。

试剂和器材

    一、试剂

    1. LB 液体培养基

    胰蛋白胨10g/L,酵母浸膏5g/L，NaCl 10g/L,用NaOH调节至pH7.5，高压灭菌。

    2. TEG缓冲液

    称取0.3g Tris加入0.1mol/L HCl溶液14.6ml，先配制成pH8.0 Tris-HCl缓冲液100ml，再加入0.37g EDTA－Na₂·2H₂O和0.99g葡萄糖，临用前加入400mg溶菌酶。

    3. 碱裂解液

    称取0.8gNaOH和1gSDS定容至100ml

    4. 乙酸钾溶液

    取60ml5mol/L KAc加入11.5ml冰乙酸和28.5ml蒸馏水

    5. 1mol/L pH8.0 Tris－HCl缓冲液

    Tris 121.14g/L  用盐酸调至pH8.0

    6. 酚／氯仿（1：1）溶液配制

   （1）将商品苯酚置65℃水浴上缓缓加热融化，取200ml融化酚加入等体积的1mol/L Tris-HCl pH8.0缓冲液和0.2g (0.1%)8－羟基喹啉，于分液漏斗内剧烈振荡，避光静置使其分项。

   （2）弃去上层水相，再用0.1mol/L Tris－HCl缓冲液pH8.0与有机相等体积混匀，充分振荡，静置分相，留取有机相。

   （3）配制氯仿／异戊醇混合液：将24份氯仿与1份异戊醇混合均匀。

   （4）等体积的酚和氯仿／异戊醇溶液混合。放置后，上层若出现水相，可吸出弃去。有机相置棕色瓶内低温保存。

    7. TE缓冲液

    称取0.12g Tris，加适量蒸馏水溶解，用1mol/L盐酸调至pH8.0并定容至100ml，加入0.037gEDTA·Na₂·2H₂O。临用前加入核糖核酸酶，为了使RNase制剂中混杂的DNase失活，临用前80℃处理10min

    8. STET溶液

    称取0.121gTris, 0.037gEDTA·Na₂·2H₂O溶于80ml蒸馏水，用1mol/L盐酸调pH8.0，并定容至100ml。称取0.584g NaCl 和 5g TritonX－100 用上述溶液溶解后定容至100ml。

    9. 溶菌酶溶液

    用10mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.0）配制。

    10. 2.5mol/L 乙酸钠溶液（pH5.2）

称取34g NaAc·3H₂O，溶于80ml水中，用HAc调至pH5.2并定容至1000ml

    二、材料

    (1) 碱裂解法：携带pBR322质粒的大肠杆菌HB101菌株

(2) 煮沸法：携带质粒的大肠杆菌菌株，如已携带质粒的DH5α菌株

    三. 器材：

    试管，Eppendorf小离心管，移液器，微量注射器，微孔滤膜细菌滤器，电热恒温水浴，电热恒温培养箱，恒温振荡器，高速台式离心机，沸水浴，冰块，接种环，旋涡混合器。

操作方法

    一、 碱裂解法

    1. 培养细菌扩增质粒

   （1）根据质粒的抗性于3ml LB液体培养基内加入适当的抗菌素

   （2）用接种环挑取1个单菌落或吸取少量菌液于含上述双抗LB液体培养基的灭过菌的试管中，37℃，振荡培养12h左右。

    2. 收集菌体和裂解细菌

   （1）取1.5ml培养液置Eppendorf小离心管内，离心，5000r/min，5min，弃去上清，保留菌体沉淀。如菌量不足可再加入培养液，重复离心，收集菌体。

   （2）将菌体沉淀悬浮于预冷的150µL TEG缓冲液内，剧烈振荡、混匀，室温放置10min

   （3）加入200µL新鲜配制的碱裂解液，加盖，颠倒数次轻轻混匀，冰上放置5min。

    3. 分离纯化质粒DNA

   （1）加入150µL冷却的乙酸钾溶液加盖加温和颠倒数次混匀，冰裕放置15min，使沉淀完全。

   （2）4℃下离心，12000r/min,5min，乙酸钾能沉淀SDS与蛋白质的复合物，并使过量的SDS－Na^＋转化为溶解度很低的SDS－K^＋一起沉淀下来。离心后，上清液若仍混浊，应混匀后再冷至0℃，重复离心。上清液转移至另一干净的Eppendorf管内。

   （3）加入等体积的酚／氯仿饱和溶液，反复振荡，离心，12000r/miin, 2min,小心吸取上层水相溶液，转移到另一个Eppendorf管中。

   （4）上述溶液中加入两倍体积的预冷无水乙醇，混合摇匀，于冰上放置10min。4℃下离心，12000r/min ,5min, 弃去上清液，并将Eppendorf管倒置在干滤纸上，空干管壁粘附的溶液。

   （5）加入70％冷乙醇1ml，洗涤沉淀物，离心，弃去上清液，尽可能除净管壁上的液珠，放置干燥或真空干燥，即得质粒DNA制品。

   （6）将DNA沉淀溶于20µLTE缓冲液（临用前加入20µg/mlRNaseA），置－20℃保存。

    采用此方法从一个菌落大约能制得2µg以上的质粒DNA，足够供给凝胶电泳以鉴定质粒DNA。

取10µLDNA溶解液加入2µL合适的酶解缓冲液和适量限制性核酸内切酶，37℃保温1－2h后加入2µL终止液，即可用于凝胶电泳分析。

    二、 煮沸法

   （1）把带有质粒的大肠杆菌1个菌落或少量培养液接种于4mlLB液体培养基，并根据质粒的抗性加入合适的抗菌素，于37℃振荡过夜。

   （2）取1.5ml培养液到Eppendorf管中，离心，8000r/min,5min，弃去上清液，倒扣Eppendorf管在干滤纸上，空干溶液。

   （3）将菌体重新悬浮于350µL STET缓冲液，加入25µL新配制的溶菌酶溶液。置旋涡混合器上旋转混匀3s

   （4）将Eppendorf管放在沸水浴中煮40s(准确)

   （5）室温下立即离心，12000r/min，10min,将上清液吸到另一个无菌的Eppendorf管中

   （6）于上清液中加入40µL的2.5mol/L乙酸钠溶液和420µL（一倍体积）异戊醇溶液（或加入2－2.5倍体积的95％乙醇，旋涡混合器上混匀后室温放置5min）

   （7）在4℃下离心，12000r/min 5min

   （8）弃去上清液，DNA沉淀用1ml70％冷乙醇洗涤，同（7）离心，吸去上清液，倒扣离心管于干滤纸上，尽量空干管内液体，室温干燥或真空干燥。

   （9）将DNA沉淀溶解在20－50µLTE缓冲液中（临用前加入20µg／ml RNaseA以除去样品中可能存在的DNA），37℃保存10min中后，－20℃保存。

注意事项

（1）实验菌种生长的好坏直接影响质粒DNA的提取，因此对存放时间较长的菌种需要事先加以活化。有关细菌培养、保存的方法请查阅微生物有关书籍。

（2）细菌培养过程要求无菌操作。抗菌素等不能高温灭菌，应使用细菌滤器过滤后使用。细菌培养液、配试剂用的蒸馏水、试管和Eppendorf离心管等有关用具和某些试剂经高压灭菌处理。接触过细菌的器具用后应消毒灭菌再洗净。

（3）制备质粒的过程中，所有操作必须暖和，不要剧烈振荡，以避免机械剪切力对DNA的断裂作用。同时也应防止DNase引起DNA的降解。

（4）加入乙酸钾溶液后，可用小玻璃棒轻轻搅开团状沉淀物，防止质粒DNA可能被包埋在沉淀物内，不易释放出来。

（5）用酚／氯仿混合液除去蛋白效果比单独使用更好，为充分除去残余的蛋白质，可以进行多次抽提，直至两相间无絮状蛋白沉淀。

（6）提取的各部操作尽量在低温条件下进行（冰浴上）

（7）为进一步除去残留蛋白质，可将DNA沉淀溶于适量TE缓冲液后，加入等体积酚／氯仿进行多次抽提，离心，吸去水相，再用乙醇沉淀DNA。

（8）沉淀DNA可用一倍体积异丙醇或2倍体积乙醇

思考题：

   1.碱法提取质粒的过程中，EDTA、溶菌酶、NaOH、SDS、乙酸钾、酚／氯仿等试剂的作用是什么？

   2.煮沸法有什么优缺点？

   3.质粒提取过程中，应注意哪些操作？为什么？