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目的要求
(1) 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
(2) 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。
实验原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N—甲叉双丙烯聚酰胺（Bis）聚合而成。
Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应戴手套，避免接触皮肤，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。化学法的引发剂是过硫酸胺（Ap），催化剂是四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸胺，在紫外光照射下引发自由基团。采用不同浓度的Acr、Bis 、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。因此可按分离物质的大小，形状来选择凝胶浓度。
尽管聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）有圆盘（disc）和垂直板（vertical slab）型之分，但两者的原理完全相同。由于垂直板形具有板薄，以冷却，分辨率高，操作简单，便于比较与扫描的优点，而为大多数实验室采用。
试剂和器材
一、试剂
分离胶缓冲液：Tris-HCl缓冲液 PH8.9:取1N盐酸48ml，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100ml。
浓缩胶缓冲液，Tris-HCl缓冲液 PH6.7:取1N盐酸48ml, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100ml。
电泳缓冲液，Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3:称取Tris 6g, 甘氨酸28.8g, 用无离子水溶解后定容至1L。用时稀释10倍。
30％Acr－Bis贮存液：30g Acr,0.8g Bis, 用无离子水溶解后定容至100ml,不容物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。
考马斯亮蓝R-250
TEMED:10%过硫酸铵（新鲜配制）；25%蔗糖溶液；0.05%溴酚蓝溶液，7%冰乙酸溶液。
二、材料
人或动物血清。
三. 器材
夹心式垂直板电泳槽，凝胶膜（135*100*1.5mm），直流稳压电源（电压300－600V，电流50－100mA, 移液管（1，5，10ml），烧杯（25，50，100ml），细长头的滴管，1ml注射器以及6号长针头，微量注射器（10µL或者50µL），培养皿（直径120mm），玻璃板（13*13cm），玻璃纸两张，日光灯一台。
操作方法
一、 安装夹心式垂直板电泳槽
夹心式垂直板电泳槽操作简单，不易渗漏，这种电泳槽两侧为有机玻璃制成的电极槽，两个电极槽中间夹有一个凝胶膜，该膜由一个U形硅胶框，长与短玻璃板及样品模槽板所组成。电泳槽由上贮槽，下贮槽和回纹状冷凝管组成，两个电极槽与凝胶模之间靠贮液槽螺丝固定，各部分按下列顺序组装：
1. 装上贮槽和固定螺丝稍钉，仰放在桌面上。
2. 将长短玻璃分别插到硅相框的凹形槽中。注意勿用手接触灌胶面的玻璃。
3. 将已插好玻璃板的凝胶膜平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。。
4. 将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。
1. 竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1％琼脂，其目的是为了封住空隙，凝固后的琼脂中应该避免有气泡。
2. 用蒸馏水试验封口处是否漏水。
夹心垂直板式电泳槽示意图
1. 导线接头2. 下贮槽3. U形橡胶框 4. 样品槽模板 5. 固定螺丝 6. 上贮槽 7. 冷凝系统 |
凝胶模子示意图
1.样品槽模板 2. 长玻璃片 3. 短玻璃片 4. U形硅胶框 |
二、 制备凝胶板
1． 分离胶制备：取Acr-Bis储备液 5.0ml； Tris-HCl缓冲液 PH8.9 2.5ml；去离子水12.39ml；TEMED 0.02ml置于小烧杯中混匀，再加入10% 0.2ml过硫酸胺，用磁力搅拌器充分混匀2min。混合后的凝胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm。用1ml注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸馏水（约3－4cm），用于隔绝空气，使胶面平整。为防止渗漏，在上下贮槽中加入略低于胶面的蒸馏水。约30－60min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限。用滤纸吸去多余的水，但不要碰破胶面。如需预电泳，则将上下贮槽的蒸馏水倒去，换上分离胶缓冲液，10mA电流电泳1h，终止电泳后，弃去分离胶缓冲液，用注射器吸取浓缩胶缓冲液洗涤胶面数次，即可制备浓缩胶。
2．浓缩胶制备：取Acr-Bis 1.0ml；Tris-HCl 缓冲液PH6.7 1.25ml；去离子水7.64ml ；TEMED 0.01ml；10%Ap 0.2ml，用磁力搅拌器充分混匀。混合均匀后用细长头的滴管将凝胶溶液加到长短玻璃板的窄缝内（及分离胶上方），距短玻璃板上缘0.5cm处，轻轻加入样品槽模板。在上下贮槽中加入蒸馏水，但不能超过短玻璃板的上缘。在距短玻璃板10cm处用日光灯或太阳光照射，进行光聚合，但不要造成大的升温。在正常情况下，照射6－7min，则凝胶由淡黄透明变成乳白色，表明聚合作用开始。继续光照30min,使凝胶聚合完全。光聚合完成后放置30－60min，轻轻取出样品模槽板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的液体，加入稀释10倍的pH8.3的Tris－甘氨酸电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5cm，即可加样。
三、加样
取血清样品0.1ml,25%蔗糖溶液0.1ml,0.05%溴酚蓝溶液0.05ml混合后，用微量注射器取5µL上述混合液，通过缓冲液，小心的将样品加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。如图
四、电泳
将直流稳压电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接（方向切勿接错），
接通冷却水，打开电泳仪开关，开始时将电流调至10mA，待样品进入分离胶时，
将电流条至20-30mA。当蓝色染料迁移至距离橡胶况下缘1cm时，将电流调回到零，关电源及冷却水。分别收集上下
贮槽电极缓冲液置试剂瓶中，4℃贮存还可用1－2次。旋松固定螺丝，取出硅橡胶框，用不锈钢铲轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。
五、染色
将凝胶放入0.05%考马斯亮蓝R250（内含20％磺基水杨酸）染色液中，使染色液没过胶板，染色30min左右。
六、脱色
用7％乙酸浸泡漂洗数次，直至背景蓝色褪去。如用50℃水浴或脱色摇床，则可缩短脱色时间。脱色液经活性炭脱色后，可反复使用。脱色后电泳区带（血清蛋白质和正常人的唾液蛋白质）如图所示。
注意事项
(1) 制备凝胶应选用高纯度的试剂，否则会影响凝胶聚合与电泳效果。
Acr和Bis是制备凝胶的关键试剂，如含有丙烯酸或其它杂质，则造成凝胶聚合时间延长，聚合不均匀或不聚合，应将它们分别纯化后方能使用。
Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，实验表明对小鼠的半致死剂量为170mg/1kg，操作时应戴手套和口罩，纯化应在通风橱内进行。
Acr的纯化：称70gAcr溶于1000ml50℃预热的氯仿中，溶解后趁热过滤。冷却后，置－20℃低温冰箱中，则由白色结晶析出，用预冷的布氏漏斗抽滤，收集白色结晶，再用预冷的氯仿淋洗几次，真空干燥后置棕色瓶中密封贮存
Bis的纯化：称12gBis，使其溶于1000ml预热40－50℃的丙酮中，趁热过滤。冷却后，置－20℃低温冰箱中，待结晶析出后，用预冷布氏漏斗抽滤，收集结晶，用预冷丙酮洗涤数次，真空干燥后置棕色瓶中密封保存。
Acr和Bis的贮液在保存过程中，由于水解的作用而形成丙烯酸和NH3，虽然溶液放在棕色试剂瓶中，4℃贮存能部分防止水解，但也只能贮存1－2个月，可测pH值（4.9－5.2）来检查试剂是否失效。
(2) 由于与凝胶聚合有关的硅橡胶条、玻璃板表面不光滑洁净，在电泳时会造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；拨胶时凝胶板易断裂，为防止此现象，所用器材均应严格的清洗。硅橡胶条的凹槽、样品模槽板及电泳槽用泡沫海绵蘸取洗洁净仔细清洗。玻璃板浸泡在重铬酸钾洗液3－4h或0.2mol/L KOH的酒精溶液中20min以上，用清水洗净，再用泡沫海绵蘸取洗洁净反复清洗，最后用蒸馏水冲洗，直接阴干或用乙醇冲洗后阴干。
(3) 安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时，位置要端正，均匀用力或用一旋紧固定螺丝，以免缓冲液渗漏。样品槽模板梳齿应平整光滑。
(4) 用琼脂封底及灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。
(5) 凝胶完全聚合后，必须放置30min 至1h，使其充分老化后才能轻轻取出样品模槽板，切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。
（6） 为防止电泳后区带拖尾，样品中盐离子强度应尽量低，含盐量高的样品可用透析法或凝胶过滤法脱盐。最大加样量不得超过100µg蛋白／100℃µL
（7）在不连续电泳体系中，预电泳只能在分离胶聚合后进行，洗净胶面后才能制备浓缩胶。浓缩胶制备后，不能进行预电泳，以充分利用浓缩胶的浓缩效应。
（8） 电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错，以免样品反方向泳动，电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过低都会影响电泳效果。
（9）电泳后，应分别收集上下贮槽的电泳缓冲液，在冰箱贮存，可用2－3次。为保证电泳结果满意，虽好使用新稀释的缓冲液。
思考题：
1. 简述聚丙烯酰胺凝胶聚合的原理，如何调节凝胶的孔径?
2. 为什么样品会在浓缩胶中被压缩成层？
3. 为什么在样品中加含有少许溴酚蓝的40％蔗糖溶液？蔗糖及溴酚蓝各有何用途？
4. 上下两槽电泳缓冲液电泳后，能否混合存放？为什么？
5. 根据实验过程的体会，总结如何做好聚丙烯酰胺垂直板电泳？哪些是关键步骤？
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