目的要求

学习应用纸层析法鉴定氨基转换反应。

实验原理

体内α-氨基酸的α-氨基在氨基转换酶的作用下，移换至α-酮酸的过程，称氨基转换作用。此类酶各有一定的特异性，普遍存在于动物各组织中。

本实验是将谷氨酸与丙酮酸在肌肉糜中谷氨酸－丙酮酸氨基转换酶（简称谷－丙转氨酶）的作用下进行氨基转化反应，然后用纸层析法检查反应体系中丙氨酸的生成。其反应过程如下：

谷丙转氨酶

丙酮酸

L－谷氨酸

L－丙氨酸

α-酮戊二酸

由于谷氨酸、丙酮酸在肌肉糜中可循其他代谢途径分解和转化，影响氨基转换过程的观察，因此在反应体系中添加碘醋酸（或溴醋酸）以抑制谷氨酸和丙酮酸的其他代谢过程。

试剂和器材

一、试剂

1%谷氨酸溶液（用1% KOH溶液调到中性）；1%丙酮酸钠溶液（用1% KOH溶液调到中性）；0.1%KHCO₃溶液；0.025％ 溴醋酸溶液（用1% KOH溶液调到中性）；2% Hac溶液；0.1%标准谷氨酸溶液；0.1%标准丙氨酸溶液；1%KOH溶液。

展开剂：酚饱和水溶液：2份酚加1份水混合放入分液漏斗，振荡。静置24小时后分层，取下层酚置瓶中备用；

显色剂：0.1%茚三酮正丁醇溶液。

二、材料

肌肉糜：取兔子肌肉2g，置研钵中，加0.9% 氯化钠溶液6ml，在低温下研磨成细浆，离心5分钟（3000转/分），弃去沉淀，得肌肉糜提取液。

三、器材

15mm×100mm试管（´ 4）；研钵（或玻璃匀浆器）；毛细管；烧杯；恒温水浴；培养皿9cm（´ 2）；直径13cm圆形滤纸；喷雾器；吹风机。

操作方法

一、转氨酶作用

1、取试管2只编号（1、2），向每个试管各加0.5ml 1%谷氨酸溶液，0.5ml 1%丙酮酸钠溶液，0.5ml 0.1%K HCO₃和0.25ml 0.025%溴醋酸, 混匀。将其中一制试管立即在沸水浴中加热2-3分钟做对照。用塞子塞住试管。将另一只试管置于45℃水浴中保温60min；

3、保温完毕，取出试管。向每只试管中各加2% Hac溶液4滴，再置于沸水浴中2min，使蛋白质完全沉淀。过滤收集滤液待用。

三、层析验证

1、取培养皿一个，加入酚水饱和溶液、约0.5cm高，取圆形滤纸一张，在中心剪一直径1-2mm的小孔，并以圆心约1cm为半径划一圆作为底线。在此底线上，用铅笔点四个等距离的原点并表明1，2，3，4；

2、用毛细管分别吸取以上两种滤液及标准谷氨酸、丙氨酸，依次点在标明号码的原点处，以吹风机吹干，再重新点样2-4次。注意斑点不能太大，一般直径约0.3cm为宜。然后将滤纸平放在盛饱和酚的培养皿上。另取一条滤纸卷成筒状，直径约1-2mm,将此小筒插入滤纸中心小孔（不可突出纸面之上），使层析滤纸通过此小筒与酚溶液相连。另取一大小相同的培养皿盖在滤纸上，此时酚溶液即由滤纸中心孔向四周扩散。

3、当酚溶液扩展到距离纸边缘约1.5cm时（约1小时），取出滤纸。用铅笔化下酚溶液扩展边缘，用吹风机吹干。用喷雾器喷以0.1%茚三酮溶液，再用热风吹干。用铅笔圈下各显色点。测定各显色点的Rf值，并解释之。

四、计算公式：

分配系数＝溶剂1中的溶质浓度/溶剂2中的溶质浓度

Rf＝原点至斑点中心的距离/原点至溶剂前沿的距离

思考题：

1.      什么叫转氨作用？

2.      根据所学理论阐明转氨作用在蛋白质的合成与分解及糖、脂肪代谢中有何作用？