目的要求

(1) 学习检定糖酵解作用的原理和方法。

(2) 了解酵解作用在糖代谢过程中的地位及生理意义。

(3) 了解有关组织代谢应注意的一些问题。

实验原理

在动物、植物、微生物等许多生物机体内，糖的无氧分解几乎都按完全相同的过程进行。本实验以动物肌肉组织中肌糖原的酵解过程为例。肌糖原的酵解作用，即肌糖原在缺氧的条件下，经过一系列的酶促反应，最后转变成乳酸的过程。肌肉组织中的肌糖原首先磷酸化，经过己糖磷酸酯、丙糖磷酸酯、甘油磷酸酯等一系列中间产物，最后生成乳酸。该过程可综合成下列反应式：

    肌糖原的酵解作用是糖类供给组织能量的一种方式。当机体突然需要大量的能量，而又供氧不足（如剧烈运动时），则糖原的酵解作用可暂时满足能量消耗的需要。在有氧条件下，组织内糖原的酵解作用受到抑制，而有氧氧化则为糖代谢的主要途径。

    糖原酵解作用的实验，一般使用肌肉糜或肌肉提取液。在用肌肉糜时，必须在无氧条件下进行；而用肌肉提取液，则可在有氧条件下进行。因为催化酵解作用的酶系统全部存在于肌肉提取液中，而催化呼吸作用（即三羧酸循环和氧化呼吸链）的酶系统，则集中在线粒体中。

    糖原或淀粉的酵解作用，可由乳酸的生成来观测。在除去蛋白质与糖以后，乳酸可以与硫酸共热变成乙醛，后者再与对羟基联苯反应产生紫罗兰色物质，根据颜色的显现而加以鉴定。

    该法比较灵敏，每毫升溶液含1－5µg乳酸即给出明显的颜色反应。若有大量糖类和蛋白质等杂质存在，则严重干扰测定，因此实验中应尽量除净这些物质。另外，测定时所用的仪器应严格地洗干净。

试剂和器材

一、试剂

对羟基联苯试剂:

称取对羟基联苯1.5g，溶于100ml 0.5% NaOH溶液，，配成1.5%的溶液。若对羟基联苯颜色较深，应用丙酮或无水乙醇重结晶。放置时间较长后，会出现针状结晶，应摇匀后使用。

0.5%糖原溶液（或淀粉溶液），20%三氯乙酸溶液，氢氧化钙（粉末），浓硫酸，饱和硫酸铜溶液，1/15mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）。

二、材料

大鼠或兔。

    三、器材

    试管及试管架，吸量管（5,2,1ml），滴管，量筒（10ml），玻璃棒，恒温水浴，沸水浴，小台秤，剪刀及镊子，表面皿，橡皮塞，研钵。

操作方法

一、处死动物和制备肌肉糜

研究机体的新陈代谢，首先要注意使所测得结果尽量符合生活机体的真实情况。杀死动物的方法对于获得真实情况有直接关系。

（1）处死动物

实验中采用的方法很多,下面介绍几种：

① 液氮固定：液氮的沸点是零下196℃，可以极迅速地将动物冷冻固定，将处于各种机能状态的机体的代谢过程在十几秒之内固定于某一阶段。实验时，先用小杜瓦瓶或广口保温瓶盛取液氮，然后将动物（如大白鼠）迅速投进液氮中，动物因体温骤然剧烈下降而死去，机体重点各个酶系及生化成分均被固定，保持受到骤冷时的天然状态。2min后，将动物去处（小白鼠固定0.5min即可）置室温下，令液氮挥发殆尽，此时动物组织变得酥脆。取一把锋利的刀，架在动物身体上，再用锤击刀背，将动物劈开后，砍取肌肉，取若干肌肉硬块放到乳钵中，迅速研成细粉，备用。

② 注入空气：取家兔，于兔耳上找好静脉血管，将灌入空气的注射器针头插入比较粗的静脉血管中，注入空气，动物于1－2min内死去。

③ 击毙：用铁锤敲击兔或大白鼠的头部，动物立即死去。

④ 斩头：将一锋利的大剪刀于动物颈下张开，左手抚摸动物，使之处于自然状态，出其不意，右手突然用力猛剪，使动物断头而死去。此法适用于体型较小的动物，如大白鼠及小白鼠。

（2）制备肌肉糜

将动物（鼠或兔）杀死后，放血，立即割取背部和腿部肌肉，在低温条件下用剪刀尽量把肌肉剪碎成肌肉糜。注意，应在临用前制备。

二、肌肉糜的糖酵解

取4支试管，编号后各加入新鲜肌肉糜0.5g。1,2号管为样品管，3,4号管为空白管。像3，4号空白管内加入20%三氯乙酸3ml，用玻璃棒将肌肉糜充分打散，搅匀，以沉淀蛋白质和终止酶的反应。然后分别向4支试管内各加入3ml磷酸缓冲液和1ml 0.5%糖原溶液（或0.5%淀粉溶液）。用玻璃棒充分搅匀，加少许液体石蜡隔绝空气，并将4支试管同时放入37℃恒温水浴中保温。

1.5h后，取出试管，立即向1，2号管内加入20%三氯乙酸3ml，混匀。将各试管内容物分别过滤，弃去沉淀。量取每个样品的滤液5ml，分别加入到已编号的试管中，然后向每管内加入饱和硫酸铜溶液1ml，混匀，再加入0.5g氢氧化钙粉末，用玻璃棒充分搅匀后，放置30min，并不是搅动内容物，使糖沉淀完全。将每个样品分别过滤，弃去沉淀。

三、乳酸的测定

取4支洁净、干燥的试管，编号，每个试管加入浓硫酸2ml，将试管至于冷水浴中，分别用小滴管取每个样品的滤液1滴或2滴，逐滴加入到已冷却的上述浓硫酸溶液中（注意滴管大小尽可能一致），随加随摇动试管，避免试管内的溶液局部过热。

    将试管混合均匀后，放入沸水浴中煮5min，取出后冷却，再加入对羟基联苯试剂2滴，吴江对羟基联苯试剂地道时关闭上，混匀试管内容物，比较和纪录各试管溶液的颜色深浅，并加以解释。

注意事项

（1）对羟基联苯试剂一定要经过纯化，是其成白色。

（2）在乳酸测定中，试管必须洁净、干燥，防止污染，影响结果。所用滴管大小尽可能一致，减少误差。若显色较慢，则可将试管放入37℃恒温水浴中保温10min，再比较各管颜色。戴手套操作。

思考题：

1.       人体和动植物体中糖的贮存形式是什么？实验时，为什么可以用淀粉代替糖原？

2.       试述糖酵解作用的生理意义？

3.       本实验关键是什么，应采取什么措施，为什么？

4.       研究组织代谢的实验应注意一些什么问题？