目的要求

（1）了解底物浓度对酶促反应的影响。

（2）掌握测定米氏常数K_m的原理和方法。

实验原理

    酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示：

式中，v──反应初速度（微摩尔浓度变化/min）；

V──最大反应速度（微摩尔浓度变化/min）；

［S］──底物浓度（mol/L）；

K_m──米氏常数（mol/L）。

这个方程表明当已知K_m及V时，酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。K_m值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。不同的酶K_m值不同，同一种酶与不同底物反应K_m值也不同，K_m值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：K_m值大，表明亲和力小；K_m值小，表明亲合力大。测K_m值是酶学研究的一个重要方法。大多数纯酶的K_m值在0.01～100mmol/L。

Linewaeaver―Burk作图法（双倒数作图法）是用实验方法测K_m值的最常用的简便方法：

    于是实验时可选择不同的［S］，测对应的v；

    本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例。以蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解。水解时有自由氨基生成，可用甲醛滴定法判断自由氨基增加的数量而跟踪反应，求得初速度。

试剂和器材

一、试剂

10～40g/L酪蛋白溶液（pH8.5）：分别取10、20、30、40g酪蛋白溶于约900ml水中，加20ml 1N NaOH连续振荡，微热直至溶解，以1N HCl 或 1N NaOH调pH至8.5，定容至1L，即生成四种不同［S］的酪蛋白标准溶液。

中性甲醛溶液：50ml分析纯甲醛加10ml0.25%酚酞乙醇溶液，以0.1N NaOH滴至微红，密闭于玻璃瓶中。

0.25%酚酞加50%乙醇溶液：2.5g酚酞以50%乙醇溶解，定容至1L。

标准0.1M NaOH溶液。

二、材料

胰蛋白酶溶液：称取2g胰蛋白酶溶于50ml蒸馏水中，放入冰箱保存。

三、器材

50ml三角烧瓶（×12），150ml三角烧瓶（×4）；吸管5ml（×1），10ml（×5）；量筒100ml（×4）；25ml碱式滴定管及滴定台，蝴蝶夹；恒温水浴；滴管。

操作方法

    取50ml三角瓶3个，加入5ml甲醛与1滴酚酞，以0.1M标准NaOH滴定至微红色，3个瓶颜色应当一致，编号。

    量取40g/L酪蛋白50ml，加入一150ml三角瓶，27℃保温10分钟，同时胰蛋白酶液也在37℃保温10分钟，然后吸取5ml酶液加到酪蛋白液中。（同时计时！）充分混合后立即取出10ml反应液（定为0时样品）加入一含甲醛的小三角瓶中（1号）加10滴酚酞；以0.1M NaOH滴定至微弱而持续的微红色。在接近终点时，按耗去的NaOHml数，每ml加一滴酚酞，在继续滴至终点，记下耗去的0.1M标准NaOH ml数。

    在4分钟、8分钟时，分别取出10ml反应液，加入2号、3号小三角瓶，同上操作，记下耗去NaOH ml数。

    以滴定度（即耗去的NaOH ml数）对时间作图，得一直线，其斜率即初速度为V₄₀（相对于40g/L的酪蛋白浓度）。

    然后分别量取30g/L、20g/L、10g/L的酪蛋白溶液，重复上述操作，分别测出V₃₀、V₂₀、V₁₀。

利用上述结果， 即求出V与K_m值。

注意事项

（1）实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种，如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速逆反应的进行，酶在一定pH及温度下部分失活等。因此，研究酶的活力以酶促反应的初速度为准。

（2）本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。因此配制各种底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性。各种试剂的加量也应准确，并严格控制准确的酶促反应时间。

思考题：

1.       试述底物浓度对酶促反应速度的影响

2.       在什么条件下，测定酶的Km值可以作为鉴定酶的一种手段，为什么？

3.       米氏方程中的Km值有何实际应用？