目的要求

(1) 掌握LDH活性测定原理；

(2) 学习用比色法测定酶活性的方法。

实验原理

乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase简称LDH，EC.1.1.1.27, L－乳酸：NAD⁺氧化还原酶）广泛存在于生物细胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化下列可逆反应。

LDH可溶于水或稀盐溶液。组织中LDH含量测定方法很多，其中紫外分光光度法更为简单、快速。鉴于NADH, NAD⁺ 在340nm及260nm 处有各自的最大吸收峰，因此以NAD⁺为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值得改变，定量测定酶的含量。本实验测定LDH活力，基质液中含丙酮酸及NADH，在一定条件下，加入一定量酶液，观察NADH在反应过程中340 nm 处光吸收减少值，减少越多，则LDH活力越高。其活力单位定义是：在25℃，pH7.5条件下A_340nm/min下降为1.0的酶量为1个单位。可定量测定每克湿重组织中LDH单位。定量测定蛋白质含量即可计算比活力（U/mg）。

利用上述原理，改变不同第五则可测定相应脱氢酶反应过程中A_340nm的改变，定量测定酶活力，如苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、甘油－3－3磷酸脱氢酶等，适用范围很广。

试剂和器材

一、试剂

50m mol/L pH6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液母液：

A: 50 m mol/L K₂HPO₄: 称K₂HPO₄1.74g加蒸馏水溶解后定容至200ml。

B: 50 m mol/L KH₂PO₄: 称KH₂PO₄3.40g加蒸馏水溶解后定容至500ml。

取溶液A 31.5ml ＋ 溶液B 68.5ml, 调节pH至6.5。置4℃冰箱备用。

10m mol/L pH 6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液用上述母液稀释得到。现用现配。

0.1mol/L pH 7.5磷酸盐缓冲液, 用上述母液稀释得到。现用现配。

NADH溶液：称3.5mg纯NADH置试管中，加0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液1ml  摇匀。现用现配。

丙酮酸溶液：称2.5mg丙酮酸钠，加0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液29ml, 使其完全溶解。现用现配试剂。

二、             材料

动物肌肉、肝、心、肾等组织。

三、             器材

组织捣碎机，紫外分光光度计，恒温水浴，移液管(5ml, 0.1ml), 微量注射器（10ul）。

操作方法

一、             制备肌肉匀浆

称取20g 兔肉, 按W/V=1/4比例加入4℃预冷的10m mol/L Ph6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液，用组织捣碎机捣碎，每次10s，连续3次。将匀浆液倒入烧杯中，置4℃冰箱中提取过夜，过滤后得到组织提取液。

二、             LDH活力测定

试验时预先将丙酮酸溶液及NADH溶液放在25℃水浴中预热。取2只石英比色杯，在1只比色杯中加入0.1m mol/L pH 7.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液3ml，置于紫外分光光度计中，在340nm处将光吸收调节至零；另一只比色杯用于测定LDH活力，依次加入丙酮酸钠溶液2.9ml, NADH溶液0.1ml，加盖摇匀后，测定340 nm光吸收值（A）。取出比色杯加入经稀释的酶液10μl，立即计时，摇匀后，每隔0.5min 测A_340nm，连续测定3min，以 A对时间作图，取反应最初线性部分，计算A_340nm/min减少值。加入酶液的稀释度（或加入量）应控制 A_340nm/min下降值在0.1－0.2之间。

三、             数据处理

计算每毫升组织提取液中LDH活力单位

          LDH活力单位（U）/ml 提取液 ＝

提取液中LDH总活力单位＝LDH活力（U）/ml ´ 总体积

注意事项

（1）实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即用，则应贮存在－20℃冰箱。

（2）酶液的稀释度及加入量应控制A_340nm/min下降值在0.1－0.2之间，以减少实验误差。

（3）NADH溶液应在临用前配制。

思考题：

1. 简述用紫外分光光度法测定以NAD⁺为辅酶的各种脱氢酶测定原理。