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目的要求
酶是生物催化剂，生物体内化学反应基本上都是在酶的催化下进行的。通过本实验了解酶催化的特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响，对于进一步掌握代谢反应及其调控机理具有十分重要的意义。
实验原理
酶与一般催化剂最主要的区别之一是酶具有高度特异（专一）性，即一种酶只能对一种底物或一类底物（此类底物在结构上通常具有相同的化学键）起催化作用，对其他底物无催化反应。例如，淀粉酶和蔗糖酶虽然都是催化糖苷键的水解，但是淀粉酶只对淀粉起作用，蔗糖酶只水解蔗糖。还原糖产物可用本乃狄试剂鉴定。
通过比较淀粉酶在不同pH、不同温度以及有无抑制剂或激活剂时水解淀粉的差异，说明这些环境因素与酶活性的关系。
试剂和器材
一、试剂
2%蔗糖溶液：用分析纯蔗糖新鲜配制。
1%淀粉溶液：1g淀粉和0.3g NaCl，用5ml蒸馏水悬浮，慢慢倒入60ml煮沸的蒸馏水中，煮沸1min，冷却至室温，加水到100ml，冰箱贮存。
0.1%淀粉溶液：0.1g淀粉，以5ml水悬浮，慢慢倒入60ml煮沸的蒸馏水中，煮沸1min，冷却至室温，加水到100ml，冰箱贮存。
本乃狄（Benedict）试剂：17.3g CuSO4•5H2O，加100ml蒸馏水加热溶解，冷却；173g柠檬酸钠和100gNa2CO3•2H2O，以600ml蒸馏水加热溶解，边加边搅匀，最后定容至1000ml。如有沉淀可过滤除去，此试剂可长期保存。
碘液：3g KI溶于5ml蒸馏水中，加1g I2，溶解后再加295ml水，混匀贮存于棕色瓶中。
磷酸缓冲液：
A液：0.2mol/L Na2HPO4
称取28.40g Na2HPO4(或71.64g Na2HPO4•12H2O)溶于1000ml水中。
B液：0.1mol/L 柠檬酸
称取21.01g柠檬酸（C6H8O7•H2O）溶于1000ml水中。
pH5.0缓冲液：10.30ml A液+9.70ml B液
pH7.0缓冲液：16.47ml A液+3.53ml B液
pH8.0缓冲液：19.45ml A液+0.55ml B液
1% CuSO4•5H2O溶液。
1% NaCl。
二、材料
(1) 唾液淀粉酶溶液：先用蒸馏水漱口，再含10ml左右蒸馏水，轻轻漱动，2分钟后吐出收集在烧杯中，即得清澈的唾液淀粉酶原液，根据酶活高低稀释50倍，即为唾液淀粉酶溶液。
(2) 蔗糖酶溶液：取1g鲜酵母或干酵母放入研钵中，加入少量石英砂和水研磨，加50ml蒸馏水，静置片刻，过滤即得。
三、仪器
恒温水浴（37℃，70℃）、沸水浴（100℃）、冰浴（0℃），试管18×180共19支，吸管1ml7支、2ml3支、5ml5支，量筒100ml1个，白瓷板，胶头滴管3支
操作方法
一、酶催化的专一性
取6支干净试管，按下表操作：
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操作项目 |
管号 |
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1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
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1%淀粉(ml) |
1 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
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2%蔗糖(ml) |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
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唾液淀粉酶原液(ml) |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
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蔗糖酶溶液(ml) |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
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蒸馏水(ml) |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
1 |
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酶促水解 |
摇匀，37℃水浴中保温10min |
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本乃狄试剂(ml) |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
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反应 |
摇匀，沸水浴中加热5～10min |
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现象 |
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二、温度对酶活力的影响
取3支试管，按下表操作：
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操作项目 |
管号 |
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1 |
2 |
3 |
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唾液淀粉酶溶液(ml) |
1 |
1 |
1 |
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pH7.0磷酸缓冲液(ml) |
2 |
2 |
2 |
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温度预处理5min（℃） |
0 |
37 |
70 |
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1%淀粉溶液(ml) |
2 |
2 |
2 |
摇匀，保持各自温度继续反应，5分钟后每隔1分钟从第2号管吸取1滴反应液于白瓷板上，用碘液检查反应进行情况，直至反应液不再变色（只有碘液的颜色），立即取出所有试管，流水冷却2min，各加1滴碘液，混匀。观察并记录各管反应现象，解释之。
三、pH对酶活力的影响
取3支试管，按下表操作：
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操作项目 |
管号 |
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1 |
2 |
3 |
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pH5.0磷酸缓冲液(ml) |
3 |
0 |
0 |
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pH7.0磷酸缓冲液(ml) |
0 |
3 |
0 |
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pH8.0磷酸缓冲液(ml) |
0 |
0 |
3 |
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1%淀粉溶液(ml) |
1 |
1 |
1 |
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预保温 |
混匀，37水浴中保温2min |
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唾液淀粉酶溶液(ml) |
1 |
1 |
1 |
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检查淀粉水解程度 |
摇匀，置37℃水浴中继续反应2分钟，每隔1分钟从第2号管中取出1滴反应液于白瓷板上，加碘液检查反应进行情况，直至反应液不再变色，即可停止反应，取出所有试管。 |
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碘液(滴) |
1 |
1 |
1 |
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现象 |
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四、酶的抑制与激活
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操作项目 |
管号 |
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1 |
2 |
3 |
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1% NaCl(ml) |
1 |
0 |
0 |
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1% CuSO4(ml) |
0 |
1 |
0 |
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蒸馏水(ml) |
0 |
0 |
1 |
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唾液淀粉酶溶液(ml) |
1 |
1 |
1 |
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0.1%淀粉溶液(ml) |
3 |
3 |
3 |
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保温反应并检查淀粉水解程度 |
摇匀，37℃水浴反应1min左右即可用碘液检查1号试管淀粉水解程度，待1号试管的反应液不再变色时取出所有试管。 |
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碘液(滴) |
1 |
1 |
1 |
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现象 |
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注意事项
（1）各人唾液中淀粉酶活力不同，因此实验2、3、4应随时检查反应进行情况。如反应进行得太快，应适当稀释唾液；反之，则应减少唾液淀粉酶稀释倍数。
（2）酶的抑制与激活最好用经透析的唾液，因为唾液中含有少量Cl－。另外，注意不要在检查反应程度时使各管溶液混杂。
思考题：
1. 何谓酶的最适pH和最适温度？
2. 说明底物浓度、酶浓度、温度和pH对酶反应速度的影响。
3. 酶作为一种生物催化剂，有哪些催化特点？
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