目的要求

（1）    了解核酸的水解方法。

（2）    掌握Sephadex脱盐和核苷酸的聚酰胺薄膜层析等较新颖的实验技术。

实验原理

    RNA的碱降解在核酸一级结构测定中应用极广，在温和的条件下用碱降解RNA时，要经过一个2′,3′-环式核苷酸的中间阶段，而后生成2′-及3′-核苷酸的混合物。DNA无2′–OH，

不能形成环式中间物，所以DNA抗碱。这一特性在分离RNA及DNA时得到了应用。

    本实验是以酵母核糖核酸为材料，采用0.5mol/L KOH在37℃下水解16h得到4种3′-及2′-核苷酸的混合物。3′(2′)-AMP；3′(2′)-CMP；3′(2′)-GMP；3′(2′)-UMP这4种核苷酸混合物又可以通过聚酰胺薄膜层析方法进行鉴定。少量盐的存在对聚酰胺薄膜层析结果有很大的影响。因此，RNA水解样品在进行聚酰胺薄膜层析前，必须进行中和脱盐。采用高氯酸进行中和，得到的高氯酸钾溶解度较低，因此水解样品中大量的盐可以通过离心的方法除去，少量的盐可以采用葡聚糖（Sephadex）凝胶层析法除去。

    葡聚糖是有许多右旋葡萄糖单位通过1,4-糖苷键连接成链状结构，再由3-氯-1,2-环氧丙烷做交联剂，将链状结构连接起来形成具有多孔网状结构的高分子化合物。其孔隙大小可通过调节教练机和葡聚糖的比例以及反应条件来控制。交联度越大，孔隙越小；交联度越小，孔隙越大。

    聚酰胺薄膜层析也是60年代以后发展起来的一种新的层析法。它是将聚酰胺作为固定相涂在支持板上的层析方法。灵敏度高，分辨力强，操作方便，速度快。

    聚酰胺对很多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的－C＝O及－NH基能与被分离物质的一定基团之间形成氢键，如酚类（包括黄酮类、鞣质等）和酸类（如核苷酸、氨基酸等）是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键；硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的按基形成氢键。被分离物质形成氢键能力的强弱，决定吸附能力的差异。在层析过程中，展层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。因此，选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺之间的分配系数能有较大的差异，经过吸附与解吸的展层过程，可以一一分离。

试剂和器材

一、试剂

标准3′-AMP：称约2mg3′-AMP加水0.1ml, 用0.4mol/LNaOH调PH至7，再加水0.1ml，置冰箱中保存备用。

标准3′-CMP，标准3′-GMP，标准3′-UMP，配制同上。

4mol/L KOH，5mol/L HClO₄，展层溶剂：冰乙酸－水（1：20V/V），60－70%以上的酵母核糖核酸，葡萄糖凝胶G-25。

二、器材

毛细管，离心机和离心管，层析柱（1×15cm），直尺和铅笔，恒温水浴，聚酰胺薄膜，层析装置，紫外光分析灯。

操作方法

一、酵母核糖核酸水解

称取酵母核糖核酸（含核糖核酸约60－70%以上）约25mg置试管中，加水1.75ml溶解，再加入0.25ml 4mol/LKOH溶液，使RNA溶液中KOH的最终浓度为0.5mol/L。加塞后，溶液于37℃保温16h进行水解。水解后，用5mol/L的高氯酸调至pH7.0，并以3000r/min离心15min，弃去沉淀，上清液即为水解液。

（一） 水解液脱盐

用Sephadex G-25柱（1×15cm）将水解液脱盐纯化。

(1) Sephadex的预处理

称取Sephadex G-25（50－100目）约5g，加入蒸馏水100ml，置室温下3h进行溶胀。

(2) 装柱

凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。同时大开下口慢速流出蒸馏水。装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡2－3h即可加样品分离。

(3) 加样

加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐（或留一极薄液层）为止。然后，由柱的上端加水解液2ml，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。

(4) 洗脱与收集

洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8－1.0ml/min。洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3ml，共收集10管。据经验，4或5号管核苷酸浓度最大，可作为层析鉴定的样品液。但因层析柱长度的差异，管号会有变化，必要时可用紫外检测A_260nm，找出浓度最大的管号。

(5) 凝胶的再生和回收

凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。若使用数次，就需要再生处理。用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95%乙醇洗两次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。

二、核苷酸的聚酰胺薄膜分析

聚酰胺薄膜层析是指混合物随流动相通过聚酰胺薄膜时，由于聚酰胺与各极性分子产生氢键吸附能力的强弱不同而将混合物分离的方法。薄膜层析和纸层析一样，在一定条件下，每个物质都具有特定的R_f值，因此，用R_f可以鉴别不同的物质。下面列出几种核苷酸在不同溶剂中的R_f值。

四种不同核苷酸在不同溶剂中的R_f值

         样品                                   溶剂

                          Ⅰ          Ⅱ           Ⅲ

          3′(2′)-UMP                   0.48          0.41          0.36

      3′(2′)-AMP                   0.82          0.82          0.72

      3′(2′)-GMP                   0.51          0.30          0.28

      3′(2′)-CMP                   f             f             f

（1）   溶剂

Ⅰ：异丙醇－冰乙酸－水（2:1:2，V/V）

Ⅱ：冰乙酸－水（1:20，V/V）

Ⅲ：丙酮－冰乙酸－水（2:1:2,V/V）

（2）   操作

① 将Ⅱ号溶剂5ml倒入层析缸内，加盖层析钟罩。

② 点样：用毛细玻璃管分别取标准核苷酸［3′(2′)–腺苷酸，3′(2′)–鸟苷酸，3′(2′)–胞苷酸和3′(2′)–尿苷酸］溶液和脱盐后的水解液。在距薄膜一端0.5－0.7cm处点样，点样量约为5µL，每点样一次后吹干再点下一次，直至合适的样品量。

③ 展层：将点好的薄膜轻轻卷成半圆，薄膜向内，光面向外，固定好，放入层析缸内，加盖层析钟罩，在层析缸中以Ⅱ号溶液展层。待展开剂距薄膜前沿2－3mm时（约10min），取出用热风吹干。

④ 层析图谱的观察和绘制：将吹干后的薄膜在紫外灯下观察，用铅笔圈出核苷酸所显示的暗紫色斑点，计算他们的R_f值。将标准核苷酸的R_f与核酸水解液各斑点R_f值相比较，由此确定RNA水解液中核苷酸的组成。

展层剂为冰乙酸：水（1：20V/V） 1. 标准3′－胞苷酸 2. 标准3′－鸟苷酸 3. 核酸水解液 4. 标准3′－尿苷酸    5. 标准3′－腺苷酸

核苷酸聚酰胺薄膜层析图谱

 

注意事项

（1）加高氯酸，须一滴一滴地加，并随时用pH试纸，观察pH改变。

（2）点样后，应在紫外灯下检查有无斑点，若有，才可展层。水解液应选用核苷酸浓度较大的管号，避免点样次数太多。

思考题：

1．为了得到更好的分离效果，如何考虑影响凝胶层析的几个因素？

2．本实验是如何通过聚酰胺薄膜层析定型鉴定样品水解液中的组份？本实验的结果说明了什么？