目的要求

    了解并掌握稀释碱法提取RNA及地衣酚显色法测定RNA含量的基本原理和具体方法。

实验原理

    由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。

    稀碱法使用稀碱（本实验用0.2%NaOH溶液）使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。

酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。

RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖，定磷和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。

试剂和器材

一、试剂

0.04MNaOH溶液；95%乙醇；无水乙醇；乙醚；1.5M硫酸；浓氨水；0.1M硝酸银;

酸性乙醇溶液，30ml乙醇加0.3ml HCl;

三氯化铁浓盐溶液，将2ml 10％三氯化铁（FeCl₃· 6H₂O）溶液加入400ml浓HCl;

苔黑酚乙醇溶液，称取6g 苔黑酚溶于95％乙醇100ml;

定磷试剂：

17％硫酸：将17ml浓硫酸（比重1084）缓缓倾入83ml水中；

2.5％鉬酸铵：2.5g 鉬酸铵溶于100ml水中；

10％抗坏血酸溶液：10g 抗坏血酸溶于100ml 水，棕色并保存溶液；

临用时将三种溶液和水按下列比例混合：

17％硫酸：2.5％鉬酸铵：10％抗坏血酸：水＝1：1：1：2（V/V）

二、材料

干酵母粉。

三、器材

乳钵；容量瓶（10ml），移液管（2.0ml, 5.0ml），量筒（10, 50ml），沸水浴，离心机，布氏漏斗，抽滤瓶，石蕊试纸，滴管等。

操作方法

一、酵母RNA提取

称5g干酵母粉置于100ml烧杯中，加入40ml0.2%NaOH溶液，沸水浴上加热30min，经常搅拌。然后加入数滴乙酸溶液使提取液呈酸性（石蕊试纸检查），3000r/min离心15min。取上清液，加入10ml酸性乙醇，边加边搅动。加毕，静置，待RNA沉淀完全后，离心。滤渣先用乙醇洗两次，每次用10ml。再用无水乙醇洗两次，每次10ml，洗涤时间可用细玻璃棒小心搅动沉淀。最后用布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量，计算：

二、RNA组份鉴定

取2g 提取的核酸，加入1.5M硫酸10ml, 沸水浴加热10分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。

1．嘌呤碱：取水解液1ml 加入过量浓氨水。然后加入1ml 0.1M硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱地银化合物沉淀。

2．核糖：取水解液1ml， 三氯化铁浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液0.2ml。放沸水浴中10min。注意观察核糖是否变成绿色。

3．磷酸：取水解液1ml，加定磷试剂1ml。在水浴中加热观察溶液是否变成蓝色。

思考题：

1．为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？

2．如何从酵母中提取到较纯的RNA?