|
目的要求
（1） 通过实验，了解紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理。
（2） 进一步熟悉紫外分光光度计的使用方法。
实验原理
核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。
核酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用 来表示。 为每升溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值（即A值）（表）。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值，即可以计算出其中RNA或DNA的含量。该法操作简便，迅速，并对被测样品无损，用量也少。
表 核酸摩尔消光系数及相光数值
|
|
ε(P) |
含磷量/(%) |
A260nm |
|
|
pH7，260nm |
1µg/ml |
|
RNA |
7700-7800 |
9.5 |
0.022-0.024 |
|
DNA-Na盐 |
6600 |
9.2 |
0.02 |
|
（小牛胸腺） |
|
|
|
蛋白质和核苷酸也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm出的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nmx吸收的比值则在1.9左右，当样品中蛋白质含量较高时，比值下降。若样品内混在有大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外光的物质，应设法先除去。
试剂和器材
一、试剂
钼酸铵－过氯酸沉淀剂：取3.6ml70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4ml蒸馏水中，即成0.25%钼酸铵－2.5%过氯酸溶液。
5-6%氨水：用25-30%氨水稀释5倍。
二、测试样品
干酵母粉（RNA）。
三、器材
电子分析天平，离心机，离心管，紫外分光光度计，烧杯，冰浴，容量瓶（50ml），移液管，试管及试管架。
操作方法
一 、准确称取待测的核酸样品0.5g，加少量0.01mol/LNaOH调成糊状，再加适量水，用5-6%氨水调至pH7.0，定容至50ml。
取两支离心管，甲管加入2ml样品溶液和2ml蒸馏水，乙管加入2ml样品溶液和2ml沉淀剂。混匀，在冰浴上放置30min，在3000r/min下离心10min。从甲、乙两管中分别吸取0.5ml上清液，用蒸馏水定容至50ml。选择厚度为1cm的石英比色杯，在260nm波长处测定A值。
二、计算：
式中， 为甲管稀释液在260nm波长处A值减去乙管稀释液在260nm波长处A值。
核酸％ ＝
在本实验中，1ml待测液中制品量为50μg。
思考题：
1．干扰本实验的物质有哪些？
2．设计排除这些干扰的实验。
上一篇：实验十一 酵母核糖核酸（RNA）的提取及组份鉴定 下一篇：实验九 蛋白质浓度的测定(四)──考马斯亮蓝染色法
|
