目的要求

    学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。

实验原理

    考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。

    考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

    蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10µg蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。

    此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl₂，乙醇，（NH₄）₂SO₄无干扰。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。

试剂与器材

一、试剂

考马斯亮蓝试剂：

考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G―250，4.7%(W/V)乙醇。

二、标准和待测蛋白质溶液

1．标准蛋白质溶液

结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液。

2．未知蛋白质溶液。

三、器材

试管及试管架， 移液管（0.1ml及5ml），UV－2000型分光光度计。

操作方法

一、标准法制定标准曲线

取14支试管，分两组按下表a平行操作。

绘制标准曲线：以A_595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

                               表a

二、微量法制定标准曲线

取12支试管，分两组按下表b平行操作。

绘制标准曲线：以A_595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

表b

三、未知样品蛋白质浓度测定

测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A_595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/ml）。

注意事项

（1） 如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5－20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。

（2） 测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。

思考题：

    根据下列所给的条件和要求，选择一种或几种常用蛋白质定量方法测定蛋白质的浓度：

（1） 样品不易溶解，但要求结果较准确。

（2） 要求在半天内测定60个样品。

（3） 要求很迅速地测定一系列试管（30支）中溶液的蛋白质浓度。