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目的要求
（1）学习Folin—酚法测定蛋白质含量的原理和方法；
（2）制备标准曲线，测定未知样品中蛋白质含量。
实验原理
目前蛋白质含量测定有两类方法，一类是利用蛋白质的物理化学性质，如折射率，比重，紫外吸收等测定得知；另一类是利用化学方法测定蛋白质含量，如微量克氏定氮，双缩脲反应，Folin—酚试剂法（Lowry法）。这两类方法各有优缺点，选用何种方法测定蛋白质含量，可根据实验要求和实验条件进行选择。目前实验室多用Folin—酚法测定蛋白质含量。此法的优点是：操作简单，迅速，不需特殊仪器设备，灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍，反应约在15min内有最大显色，并至少可以稳定几个小时。其不足之处就是此反应受多种因素干扰。在测定时应排除干扰因素或做空白试验消除。
此法是在Folin—酚法的基础上引入双缩脲试剂，因此凡干扰双缩脲反应的基团，如-CO-NH2,-CH2-NH2,-CS-NH2以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如Tris缓冲剂以及蔗糖，硫酸铵，巯基化合物均可干扰Folin—酚反应。此外，所测的蛋白质样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。而浓度较低的尿素（约0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸钠（1%），硝酸钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）对显色无影响，这些物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线。若所测的样品中含硫酸铵，则需增加碳酸钠—氢氧化钠浓度即可显色测定。若样品酸度较高，也需提高碳酸钠—氢氧化钠浓度1—2倍，这样即可纠正显色后色浅的弊病。
Folin—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸，硫酸，溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。
本法可测定范围是25—250ug蛋白质。
试剂和器材
一、试剂
Folin—酚试剂:
试剂甲：
1) 4%碳酸钠溶液
2) 0.2mol/L氢氧化钠溶液
3) 1%硫酸铜溶液
4) 2%酒石酸钾钠溶液。
临用前将（1）与（2）等体积配制碳酸钠—氢氧化钠溶液。（3）与（4）等体积配制成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。然后这两种试剂按50:1的比例配合，即成Folin—酚试剂甲。此试剂临用前配制，一天内有效。
试剂乙：
称钨酸钠（Na2WO2•2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4•2H2O）25g置2000ml磨口回流装置内，加蒸馏水700ml，85%磷酸50ml和浓硫酸100ml。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水50ml及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1000ml，过滤即成Folin—酚试剂乙贮存液，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕色瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。
试剂乙贮存液在使用前应确定其酸度。以之滴定标准氢氧化钠溶液（1mol/L左右），以酚酞为指示剂，当溶液颜色由红→紫红→紫灰→墨绿时即为滴定终点。该试剂的酸度应为2mol/L左右，将之稀释至相当于1mol/L酸度应用。
二、标准和待测蛋白质溶液
1. 标准蛋白质溶液
结晶牛血清白蛋白或酪蛋白，预先经微量克氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度配制成150ug/ml蛋白溶液
2. 待测蛋白质溶液
人血清，使用前稀释150倍。
三、器材
试管及试管架；0.5,1,及5ml移液管，恒温水浴，UV－2000型分光光度计。
操作方法
一、制作标准曲线
取14支试管，分两组按下表平行操作：
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试管编号
试剂处理 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
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标准蛋白质溶液/ml |
0 |
0.1 |
0.2 |
0.4 |
0.6 |
0.8 |
1.0 |
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蒸馏水/ml |
1.0 |
0.9 |
0.8 |
0.6 |
0.4 |
0.2 |
0 |
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Folin-酚甲试剂/ml |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
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摇匀，于20—25℃放置10min |
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Folin-酚乙试剂/ml |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
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迅速摇匀，30℃（或室温20—25℃）水浴保温30min，以蒸馏水为空白，在640nm*处比色 |
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640 |
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* 由于这种显色化合物组成尚未确定，它在可见光红光区呈现较宽吸收峰区。不同书籍选用不同的波长，有选用500或540nm的，有选用660,700或750nm的。选用较高波长，样品呈现较大的光吸收。本实验选用640nm。
绘制标准曲线：以A640值为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
二、未知样品蛋白质浓度测定
取4支试管，分2组，按下表平行操作：
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试管编号
试剂处理 |
空白管
×2 |
样品管
×2 |
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血清稀释液/ml |
0 |
0.2 |
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蒸馏水/ml |
1.0 |
0.8 |
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Folin－酚甲试剂/ml |
5.0 |
5.0 |
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摇匀，于20—25℃放置10min |
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Folin－酚乙试剂/ml |
0.5 |
0.5 |
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迅速摇匀，30℃（或室温20—25℃）水浴保温30min，以蒸馏水为空白，在640nm*处比色 |
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640 |
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三、计算
注意事项
(1) Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而Folin－酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白 质作用生成碱性的铜－蛋白质溶液。当Folin－酚乙试剂加入后，应迅速摇匀（加一管摇一管），使还原反应产生在磷钼酸－磷钨酸试剂被破坏之前。
(2) 血清稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将血清酌情稀释。
思考题：
1. Folin－酚测定蛋白质的原理是什么？
2. 有哪些因素可干扰Folin－酚测定蛋白含量？
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