目的要求

学习双缩脲法测定蛋白质的原理和方法。

实验原理

具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，因此蛋白质在碱性溶液中，也能与Cu²⁺形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓度。

紫红色铜双缩脲复合物分子结构为：

试剂和器材

一、试剂

    双缩脲试剂：将0.175g硫酸铜（CuSO₄•5H₂O）溶于约15ml蒸馏水，置于100ml容量瓶中，加入30ml浓氨水，30ml冰冷的蒸馏水和20ml饱和NaOH溶液，摇匀，室温放置1

—2h，再以蒸馏水定容至100ml后，摇匀，备用。

二、标准和待测蛋白质溶液

1.       标准蛋白溶液

10mg/ml牛血清白蛋白溶液或相同浓度的酪蛋白溶液（用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制）。作为标准用的蛋白质要预先用微量克氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度称量，配制成标准溶液。

2.       待测蛋白质溶液

人血清（稀释10倍）。测试其他蛋白质样品应稀释适当倍数，使其浓度在标准曲线测试范围内。

三、器材

试管，试管架，恒温水浴，UV-2000型分光光度计。

操作方法

一、制作标准曲线

取12支干试管分成两组，按下表平行操作：

取两组测定的A₅₄₀值的平均值，即A₅₄₀为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

二、样品测定

取4支试管分成两组，按下表平行操作：

三、计算

取两组测定的平均值计算：

其中,Y为标准曲线查得蛋白质得浓度（mg/ml），N为稀释倍数，V为血清样品所取的体积（ml），c为样品原浓度（mg/ml）。

注意事项

（1）本实验方法测定范围1－10mg蛋白质。

（2）须于显色后30min内比色测定。30min后，可有雾状沉淀发生。各管由显色到比色的时间应尽可能一致。

（3）有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。

思考题：

1.干扰本实验的因素有哪些？