目的要求

（1）通过实验了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。

（2）掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。

实验原理

    蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的基团除N―端α―氨基与C―端α―羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如酚基、巯基、胍基、咪唑基等集团，他们都能解离为带电基团。因此，在蛋白质溶液中存在着下列平衡：

阳离子               两性离子                   阴离子

      pH < pI               pH = pI                    pH > pI

电场中：  移向阴极             不移动                     移向阳极

调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同pH的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可确定蛋白质的等电点。

试剂和器材

一、试剂

    1mol/L乙酸：吸取99.5%乙酸（比重1.05）2.875ml，加水至50ml。

    0.1mol/L乙酸：吸取1mol/L乙酸5ml，加水至50ml。

    0.01mol/L乙酸：吸取0.1mol/L乙酸5ml，加水至50ml。

0.2mol/LNaOH：称取NaOH2.000g，加水至50ml，配成1mol/LNaOH。然后量取1mol/L NaOH 10ml，加水至50ml,配成0.2mol/L NaOH。

0.2mol/L盐酸：吸取37.2%（比重1.19）盐酸4.17ml，加水至50ml，配成1mol/L盐酸。然后吸取1mol/L盐酸10ml，加水至50ml，配成0.2mol/L盐酸。

0.01%溴甲酚绿指示剂：称取溴甲酚绿0.005g，加0.29ml 1mol/L NaOH，然后加水至50ml。

0.5%酪蛋白溶液：称取酪蛋白（干酪素）0.25g放入50ml容量瓶中，加入约20ml水，再准确加入1mol/L NaOH 5ml，当酪蛋白溶解后，准确加入1mol/L乙酸5ml，最后加水稀释定容至50ml，充分摇匀。

二、器材

试管架，试管：15ml×6，刻度吸管：1ml×4，2ml×4，10ml×2，胶头吸管×2。

操作方法

一、蛋白质的两性反应

（1）取一支试管，加0.5%酪蛋白1ml，再加溴甲酚绿指示剂4滴，摇匀。此时溶液呈蓝色，无沉淀生成。

（2）用胶头滴管慢慢加入0.2mol/L盐酸，边加边摇知道有大量的沉淀生成。此时溶液的pH值接近酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化。

（3）继续滴加0.2mol/L盐酸，沉淀会逐渐减少以至消失。观察此时溶液颜色的变化。

（4）滴加0.2mol/L NaOH 进行中和，沉淀又出现。继续滴加0.2mol/L NaOH，沉淀又逐渐消失。观察溶液颜色的变化。

二、酪蛋白等电点的测定

（1）取同样规格的试管7支，按下表精确地加入下列试剂：

（2）充分摇匀，然后向以上各试管依次加入0.5%酪蛋白1ml，边加边摇，摇匀后静置5min，观察各管的混浊度。

（3）用-、+、++、+++等符号表示各管的混浊度。根据混浊度判断酪蛋白的等电点。最混浊的一管的pH值即为酪蛋白的等电点。

注意事项

缓冲液的pH值必须准确。

思考题：

1．解释蛋白质两性反应中颜色及沉淀变化的原因。

2．该方法测定蛋白质等电点的原理是什么？