目的要求

    学习双向纸层析的原理和操作方法，进行混合氨基酸的分离分析。

实验原理

    纸层析是以滤纸作支持物，用一定的溶剂系统展开，使混合样品达到分离分析的层析方法。其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中，点样在滤纸的一端；再选用适当的溶剂系统，从点样的一端通过毛细现象向另一端展开，展开完毕，取出滤纸晾干或烘干，再以适当的显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。样品经展开后其一物质在纸层析谱上的位置常用比移值R_f来表示。

R_f  =

    纸层析可看作是溶质（样品）在固定相与流动相之间的连续抽提，由于溶质在两相之间的分配系数不同而达到分离。一定的物质在两相间有固定的分配系数，因而在恒定条件（液剂、PH、温度）下，各物质有固定的R_f值，据此可达到分析鉴定的目的。

    由于滤纸纤维可吸收20～25%的水分；且其中6～7%以氢键形式与纤维素上羟基结合，一般条件下难脱去；所以纸层析实际上是以水相作固定相，展开的溶剂作流动相。

    纸层析操作按溶剂展开方向可分为上行、下行和径向三种。氨基酸分离一般用上行法。上行法又分单向（成分较为简单的样品）和双向（单向时斑点重叠分离不开，于是在其垂直方向用另一种溶剂系统展层）。双相层析谱可分辨十几种以上的样品。

    层析滤纸要求：

（1）质地均匀，平整无折痕，厚薄适当，溶剂能匀速展开。

（2）机械强度好，溶剂展开后能保持原状，不易折到。

（3）有一定纯度而少杂质，以免影响层析图谱背景。

（4）纤维松紧适宜，一般选用中速滤纸，或根据溶剂选择。如丁醇类粘度大，宜用快速滤纸；而氯仿、石油醚展开快，宜用慢速滤纸。

层析溶剂要求：

（1）被分离物质在该溶剂系统中R_f在0.05～0.8之间，各组分之R_f值相差最好能大于0.05，以免斑点重叠。

（2）溶剂系统中任一组分与分离物之间不能起化学反应。

（3）分离物质在溶剂系统中的分配较恒定，不随温度而变化，且易迅速达到平衡，这样所得斑点较圆整。

本实验采用八种混合氨基酸为样品，用酸性和碱性两种溶剂进行双向层析，以茚三酮为显色剂，可获得分离清晰的层析图谱。图谱示意如下：

试剂和器材

一、试剂

0.1%（W/V）茚三酮溶丙酮液。

溶剂系统：第一相：正丁醇∶88%甲酸∶水＝15∶3∶2（V/V）；

          第二相：正丁醇∶吡啶∶95%乙醇∶水＝5∶1∶1∶1（V/V）。

二、测试样品

标准氨基酸混合溶液：亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸、组氨酸、丝氨酸各100mg溶于50ml 0.01M盐酸中。

三、器材

层析缸25×40cm（×2）；培养皿15cm（×2）；喷雾器；毛细管内径0.1cm；电吹风；烘箱。层析滤纸14×11cm；铅笔，尺。

操作方法

一、点样

取层析滤纸一张（14×11cm），在距纸边1.2cm处划一基线；再将纸转90°，距纸边1.2cm处作一线与上线垂直。以毛细管吸取混合氨基酸溶液，点与二线交点处（见图4-1），点的直径控制在2mm左右，不可过大。待样品干燥后再点一次。滤纸上点样斑点干燥后，把滤纸卷成圆筒形，纸的两边以铬丝相连，但不可重叠相碰。

二、展层

在层析缸中平稳的放入装有第一相层析溶剂的培养皿。将圆筒形滤纸放入，点样一段接触溶剂，以点样处不浸入溶剂为准。待溶剂自下而上均匀展开，约2小时后溶剂到达距纸边0.5cm处取出滤纸，悬挂于室温中，以电吹风充分吹尽溶剂。然后裁去未走过溶剂的滤纸边缘，将滤纸转90°，卷成如前圆筒状，放入盛第二相溶剂的层析缸内展开（操作同上），约1小时后溶剂展开到距纸边0.5cm时取出，以电吹风吹尽溶剂使其干燥。

纸层析点样、展层 （X, Y分别为云点至斑点中心和溶剂前沿的距离，x为点样原点）

 

三、显色

以喷雾器将茚三酮均匀地喷在滤纸上，然后悬滤纸于65℃烘箱内加热20分钟，即可看到紫红色氨基酸斑点，将图谱上的斑点用铅笔圈出。

注意事项

（1）烘箱加热温度不可过高，且不可有氨的干扰，否则图谱背景会泛红。

（2）第一相溶剂最好在使用前再按比例混合，否则会引起酯化影响层析效果。

（3）接触滤纸时，要戴手套。

思考题：

1．酸性与碱性溶剂系统对氨基酸极性基团的解离各有何影响？

2．为什么展层时要用两种溶剂系统？