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目的要求
了解并掌握比色测定血清总胆固醇的原理和方法。
实验原理
胆固醇是环戊烷多氢菲的衍生物，它不仅参与血浆蛋白的组成，而且也是细胞的必要结构成分，还可以转化成胆汁酸盐、肾上腺皮质激素和维生素D等。胆固醇在体内以游离胆固醇及胆固醇酯两种形式存在，统称总胆固醇。总胆固醇的测定有化学比色法和酶学方法两类。本实验采用前一方法。
胆固醇及其酯在硫酸作用下与邻苯二甲醛产生紫红色物质，此物质在550nm波长处有最大吸收，可用比色法作总胆固醇的定量测定。胆固醇含量在400mg/100ml内，与OD值呈良好线性关系。
本法不必离心，颜色产物也比较稳定，胆红素及一般溶血对结果影响不大，严重溶血者才使结果偏高。本法在20～37℃条件下显色，显色后5分钟开始至半小时以上颜色基本稳定。温度过低，显色剂强度减弱；加混合酸后振摇过激能使产热过高，也可使显色减弱。
试剂和器材
一、试剂
邻苯二甲醛试剂：称取邻苯二甲醛50mg，以无水乙醇溶至50ml冷藏，有效期为一个半月。
混合酸：冰乙酸100ml与浓硫酸100ml混合。
标准胆固醇贮存液（1mg/ml）：准确称取胆固醇100mg，以冰乙酸溶至100ml。
标准胆固醇工作液（0.1mg/ml）：将上述贮存液以冰乙酸稀释10倍: 即取10ml用冰乙
酸稀释至100ml。
二、测试样品
0.1ml人血清以冰乙酸稀释至4.00ml。
三、器材
试管1.5×15cm（×12）；吸管0.5ml（×5），10ml（×1），0.1ml（×1）；WFJ UV-2000型
分光光度计。
操作方法
一、制作标准曲线
取9支试管编号后，按下表顺序加入试剂：
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管号 |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
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标准胆固醇工作液(ml) |
0 |
0.05 |
0.10 |
0.15 |
0.20 |
0.25 |
0.30 |
0.35 |
0.40 |
|
冰醋酸(ml) |
0.40 |
0.35 |
0.30 |
0.25 |
0.20 |
0.15 |
0.10 |
0.05 |
0 |
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邻苯二甲醛试剂(ml) |
0.20 |
0.20 |
0.20 |
0.20 |
0.20 |
0.20 |
0.20 |
0.20 |
0.20 |
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混合酸(ml) |
4.00 |
4.00 |
4.00 |
4.00 |
4.00 |
4.00 |
4.00 |
4.00 |
4.00 |
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相当未知血清中
总胆固醇量(mg%) |
0 |
50 |
100 |
150 |
200 |
250 |
300 |
350 |
400 |
加毕，温和混匀，20～37℃下静置10分钟，与550nm下比色测定，以总胆固醇量（mg%）为横坐标，OD值为纵坐标做出标准曲线。
二、样品测定
取3支试管编号后，分别加入试剂，与标准曲线同时作比色测定：
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管号 |
对照 |
样品① |
样品② |
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稀释的未知血清样品(ml) |
0 |
0.40 |
0.40 |
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邻苯二甲醛试剂(ml) |
0.20 |
0.20 |
0.20 |
|
冰乙酸(ml) |
0.40 |
0 |
0 |
|
混合酸(ml) |
4.00 |
4.00 |
4.00 |
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OD值 |
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加毕，温和混匀，20～37℃下静置10分钟，与550nm下比色测定，测得OD值从标准曲线中可查出样品的胆固醇含量。
注意事项
（1）混合酸粘度大，要用封口膜充分混匀。保温后如有分层，再次混匀。
（2）混合酸配制时，将浓硫酸加入冰乙酸中，次序不可颠倒。
思考题：
1. 本实验操作中特别需要注意的是什么，为什么？
2. 酯类难溶于水，将它们均匀分散在水中则形成乳浊液，为什么正常人血浆和血清中含有酯类虽多，但却清澈透明？
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