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目的要求：
掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。
实验原理:
在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。
试剂和器材
一、试剂
3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000ml容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325ml，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000ml。
葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为2.0mg/ml。
6mol/L HCl：取250ml浓HCl（35%～38%）用蒸馏水稀释到500ml。
碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。
6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中。
0.1% 酚酞指示剂。
二、材料
藕粉，玉米淀粉。
三、器材
WFJ UV－2000型分光光度计，水浴锅，电炉，15mm×180mm试管。
操作方法
一、葡萄糖标准曲线制作
取5支15mm×180mm试管，按下表加入2.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。
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管号 |
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葡萄糖标准液 |
蒸馏水 |
葡萄糖含量 |
OD540 |
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/ml |
/ml |
/mg |
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0
1 |
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0
0.2 |
1
0.8 |
0
0.4 |
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2 |
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0.4 |
0.6 |
0.8 |
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3 |
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0.6 |
0.4 |
1.2 |
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4 |
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0.8 |
0.2 |
1.6 |
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5 |
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1 |
0 |
2 |
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在上述试管中分别加入DNS试剂2.0ml，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。以1.0ml蒸馏水代替葡萄糖标准液按同样显色操作为空白调零点。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
二、样品中还原糖的提取
准确称取 0.5g藕粉，放在100ml烧杯中，先以少量蒸馏水(约2 ml)调成糊状，然后加入40ml蒸馏水，混匀，于50℃ 恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出混。过滤，将滤液全部收集在50ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。
三、样品总糖的水解及提取
准确称取0.5g玉米淀粉，放在锥形瓶中，加入6mol/L HCl 10ml，蒸馏水15ml，在沸水浴中加热0.5h，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕，冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100ml，过滤取滤液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。
四、样品中含糖量的测定
取7支15mm×180mm试管，分别按下表加入试剂：
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项目 |
空白 |
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还原糖 |
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总糖 |
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0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
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样品溶液/ml |
0 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
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3,5-二硝基水杨酸试剂/ml |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
加完试剂后，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。测定后，取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖量。
五、结果处理
按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量：
式中：C──还原糖或总糖提取液的浓度，mg/ml；
V──还原糖或总糖提取液的总体积，ml；
m──样品重量，g；
1000──mg换算成g的系数。
注意事项
标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色
思考题
1. 比色时为什么要设计空白管？
2. 比较费林试剂比色法与3,5-二硝基水杨酸比色法测定可溶性淀粉中还原糖和总糖的结果，这两种方法各有何优点？
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