所谓层析，就是利用样品中各组成成分的不同物理化学性质的差异，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，由于各组分随流动相前进的速率不同，从而把它们分离开来的技术。这些物理特性包括分子的大小、形状、所带电荷、挥发性、溶解性及吸附性质等。层析系统的必要组分有：

a. 固定相，可以是一种固体、凝胶或固定化的液体，由某种支持基质所支撑。

b. 层析床，把固定相填入一个玻璃或金属柱中，或者薄薄涂布一层于玻璃或塑料片上

或者吸附在醋酸纤维纸上。

c. 流动相，起溶剂作用的液体或气体，用于协助样品平铺在固定相表面及将其从层析

床中洗脱下来。

d. 运送系统，用来促使流动相通过层析床。

e. 检测系统，用于检测试管中的物质。

由于不同物质固定相相互作用的强弱不同，从而使得分离目的得以实现。

要点：层析系统中，与固定相作用强的物质受到的阻力最大，而作用弱的物质受到的阻力很小，因而不同物质在层析过程中的迁移距离和洗脱时间不同。

按照操作形式的不同，层析技术可分为纸层析、薄层层析和柱层析三类。本节重点介绍生物化学分离中常用的几种层析方法：

一、             纸层析（paper chromatography）：

纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析。滤纸纤维与水有较强的亲和力，能吸收22%左右的水，其中6%～7%的水是以氢键形式与纤维素的羟基结合。由于滤纸纤维与有机溶剂左右的亲和力很弱，故而在层析时，以滤纸纤维及其结合的水作为固定相，以有机溶剂作为流动相。纸层析对混合物进行分离时，发生两种作用：第一种是溶质在结合于纤维上的水与流过滤纸的有机相进行分配（即液—液分离）；第二种是滤纸纤维对溶质的吸附及溶质溶解于流动相的不同分配比进行分配（即固—液分配）。虽然混合物的彼此分离是这两种因素共同作用的结果。

在实际操作中，点样后的滤纸一端浸没于流动相液面之下，由于毛细管作用，有机相即流动相开始从滤纸的一端向另一端渗透扩展。当有机相沿滤纸经点样处时，样品中的溶质就按各自的分配系数在有机相与附着于滤纸上的水相之间进行分配。一部分溶质离开原点随着有机相移动，进入无溶质区，此时又重新进行分配；一部分溶质从有机相进入水相。在有机相不断流动的情况下，溶质就不断地进行分配，沿着有机相流动的方向移动。因样品中各种不同的溶质组分有不同的分配系数，移动速率也不一样，从而使样品中各组分得到分离和纯化。

可以用相对迁移率（R_f）来表示一种物质的迁移：

R_f＝组分移动的距离/溶剂前沿移动的距离

  ＝原点至组分斑点中心的距离/原点致溶剂前沿的距离

在滤纸、溶剂、温度等各项实验条件恒定的情况下，各物质的R_f值是不变的，它不随溶剂移动距离的改变而变化。R_f与分配系数K的关系：R_f＝1/（1+αK）。

Α是由滤纸性质决定的一个常数。由此可见，K值越大，溶质分配于固定相的趋势越大，而R_f值越小；反之，K值越小，则分配于流动相的趋势越大，R_f值越大。R_f值是定性分析的重要指标。

在样品所含溶质较多或某些组分在单相纸层析中的R_f比较接近，不易明显分离时，可采用双向纸层析法。该法是将滤纸在某一特殊的溶剂系统中按一个方向展层以后，即予以干燥，再转向90^o，在另一溶剂系统中进行展层，待溶剂到达所要求的距离后，取出滤纸，干燥显色，从而获得双向层析谱。应用这种方法，如果溶质在第一溶剂中不能完全分开，而经过第二种溶剂的层析能得以完全分开，大大的提高了分离效果。纸层析还可以与区带电泳法结合，能获得更有效的分离方法，这种方法称为指纹谱法。

二、             薄层层析（thin-layer chromatography，TLC）：

薄层层析是在玻璃板上涂布一层支持剂，待分离样品点在薄层板一端，然后让推动剂从上流动，从而使各组分得到分离的物理方法。常用的支持剂有：硅胶G、硅胶GF、氧化铝、纤维素、硅藻土、硅胶G硅藻土、纤维素G、DEAE-纤维素、交联葡聚糖凝胶等。使用的支持剂种类不同，其分离原理也不尽相同，有分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析等多种。

TLC系统组成

一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。物质之所以能在固体表面停留，这是因为固体表面的分子和固体内部分子所受的吸引力不同。在固体内部，分子之间互相作用的力是对称的，其力场互相抵消。而处于固体表明的分子所收的力是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作用力大，而表面层所受的作用力小，因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可

以建立动态平衡，称为吸附平衡。吸附层析过程就

是不断地产生平衡和不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。

薄层层析设备简单，操作简单，快速灵敏。改变薄层厚度，既能作分析鉴定，又能做少量制备。配合薄层扫描仪，可以同时做到定性定量分析，在生物化学、植物化学等领域是一类广泛应用的物质分离方法。

三、             离子交换层析（ion exchange chromatography）：

离子交换层析是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达到分离的目的的一种柱层析法。该法可以同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、选择性好，分离速度快等优点，是当前最常用的层析法之一，常用于多种离子型生物分子的分离，包括蛋白质、氨基酸、多肽及核酸等。

离子交换层析对物质的分离通常是在一根充填有离子交换剂的玻璃交换剂的玻璃管中进行的。离子交换剂为人工合成的多聚物，其上带有许多可电离基团，根据这些基团所带电荷的不同，可分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。含有预被分离的离子的溶液通过离子交换柱时，各种离子即与离子交换剂上的荷电部位竞争结合。任何离子通过柱时的移动速率取决于与离子交换剂的亲和力、电离程度和溶液中各种竞争性离子的性质和浓度。

离子交换剂是由基质、荷电基团和反离子构成，在水中呈不溶解状态，能释放出反离子。同时它与溶液中的其他离子或离子化合物相互结合，结合后不改变本身和被结合离子或离子化合物的理化性质。

离子交换层剂与水溶液中离子或离子化合物所进行的离子交换反应是可逆的。假定以RA代表阳离子交换剂，在溶液中解离出来的阳离子A^＋与溶液中的阳离子B^＋可发生可逆的交换反应：RA+B⁺↔RB+A⁺；该反应能以极快的速度达到平衡，平衡的移动遵循质量作用定律。

溶液中的离子与交换剂上的离子进行交换，一般来说，电性越强，越易交换。对于阳离子树脂，在常温常压的稀溶液中，交换量随交换剂离子的电价增大而增大，如Na^＋<Ca²⁺<Al³⁺<Si⁴⁺。如原子价数相同，交换量则随交换离子的原子序数的增大而增大，如Li+<Na+<K+<Pb+。在稀溶液中,强碱性树脂各负电性基团的离子结合力次序是：CH₃COO^—<F^—<OH^—<HCOO^—<Cl^—<SCN^—<Br^—<CrO₄^2—<NO₂^—<I^—<C₂O₄^2—<SO₄^3—<柠檬酸根。弱酸性阴离子交换树脂对各负电性基团结合力的次序为：F^—<Cl^—<Br^—=I^—=CH₃COO^—<MoO₄^2—<PO₄^3—<AsO₄^3—<NO₃^—<酒石酸根<柠檬酸根<CrO₄^2—<SO₄^2—<OH^—。两性离子如蛋白质、核苷酸、氨基酸等与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的理化性质和特定的条件呈现的离子状态：当pH<pI时，能被阳离子交换剂吸附；反之，当pH>pI时，能被阴离子交换剂吸附。若在相同pI条件下，且pI>pH时，pI越高，碱性就越强，就越容易被阳离子交换剂吸附。

选择离子交换剂的一般原则：

1）选择阴离子抑或阳离子交换剂，决定于被分离物质所带的电荷性质。如果被分离物质带正电荷，应选择阳离子交换剂；如带负电荷，应选择阴离子交换剂；如被分离物为两性离子，则一般应根据其在稳定pH范围内所带电荷的性质来选择交换剂的种类。

2）强型离子交换剂使用的pH范围很广，所以常用它来制备去离子水和分离一些在极端pH溶液中解离且较稳定的物质。

3）离子交换剂处于电中性时常带有一定的反离子，使用时选择何种离子交换剂，取决于交换剂对各种反离子的结合力。为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此，强酸型和强碱型离子交换剂应分别选择H型和OH型；弱酸型和弱碱型交换剂应分别选择Na型和Cl型。

4）交换剂的基质是疏水性还是亲水性，对被分离物质有不同的作用性质，因此对被分离物质的稳定性和分离效果均有影响。一般认为，在分离生命大分子物质时，选用亲水性基质的交换剂较为合适，它们对被分离物质的吸附和洗脱都比较温和，活性不易破坏。

主要操作要点：

1)      交换剂的预处理、再生与转型

2)      交换剂装柱

3)      样品上柱、洗脱和收集

四、             凝胶层析法（gel chromatography）：

凝胶层析法也称分子筛层析法，是指混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高，除常用于分离纯化蛋白质、核酸、多糖、激素等物质外，还可以用于测定蛋白质的相对分子质量，以及样品的脱盐和浓缩等。

凝胶是一种不带电的具有三维空间的多空网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。如果两种以上不同相对分子质量的分子都能进入凝胶颗粒网孔，但由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此也可以分离开来。

常用的凝胶类型有：交联葡聚糖凝胶，琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶等。

凝胶层析的原理 A.      小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留，大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过； B.       （1）蛋白质混合物上柱; （2）洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内，大分子则被排阻于颗粒之外; （3）小分子被滞留，大分子向下移动，大小分子开始分开; （4）大小分子完全分开; （5）大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在行进中。

 

五、             高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）：

高效液相色谱是一种多用途的层析方法，可以使用多种固定相和流动相，并可以根据特定类型分子的大小、极性、可溶性或吸收特性的不同将其分离开来。高效液相色谱仪一般由溶剂槽、高压泵（有一元、二元、四元等多种类型）、色谱柱、进样器（手动或自动）、检测器（常见的有紫外检测器、折光检测器、荧光检测器等）、数据处理机或色谱工作站等组成。

其核心部件是耐高压的色谱柱。HPLC柱通常由不锈钢制成，并且所有的组成元件、阀门等都是用可耐高压的材料制成。溶剂运送系统的选择取决于：①等度（无梯度）分离：在整个分析过程中只使用一种溶剂（或混合溶剂）；②梯度洗脱分离：使用一种微处理机控制的梯度程序来改变流动相的组分，该程序可通过混合适量的两种不同物质来产生所需要的梯度。

由于HPLC的高速、灵敏和多用途等优点，它成为许多生物小分子分离所选择的方法，常用的是反相分配层析法。大分子物质（尤其是蛋白质和核酸）的分离通常需要一种“生物适合性”的系统如Pharmacia FPLC系统。在这类层析中用钛、玻璃或氟化塑料代替不锈钢组件，并且使用较低的压力以避免其生物活性的丧失。这类分离用离子交换层析、凝胶渗透层析或疏水层析等方法来完成。

六、             气相色谱（gas chromatography，GC）：

现代的气相色谱使用长达50m的毛细管层析柱（内径为0.1~0.5mm）。固定相通常为一种交联的硅多体，附着在毛细管内壁成一层膜。在正常操作温度下，其性质类似于液体膜，但要结实的多。流动相（载气）通常为氮气或氢气。依据不同组分在载气与硅多体相之间的分配能力不同达到选择性分离的目的。大多数生物大分子的分离受柱温的影响。柱温有时在分析过程中维持恒定（等温——通常50~250℃），更常见的为设定一个增温的程序（如以每分钟10℃的速度从50℃升高到250℃）。样品通过一个包含有气紧阀门的注射孔注入柱顶部。柱中的产物可用下列方法检测出：

1) 火焰离子检测法：流出气体通过一种可使任何有机复合物离子化的火焰，然后被一

个固定在火焰顶部附近的电极所检测。

    2) 电子捕获法：使用一种发射β－射线的放射性同位素作为离子化的方式。这种方法可以检测极微量（pmol）的亲电复合物。

3) 分光光度计法：包括质谱分析法（GC－MS）和远红光谱分析法（GC－IR）。

4) 电导法：流出气体中的组成成分的改变会引起铂电缆电阻的变化。

七、亲和层析：

亲和层析是利用某些生物分子之间专一可逆结合特性的一种高度专一的吸附层析类型。固体基质具有一个与之共价相连的特殊结合分子（如配位体），连接后的配体对互补分子的亲和力不会改变。配体是发生亲和反应的功能部位，也是载体和被亲和分子之间的桥梁。配体本身必须有两个基团：一个能与载体共价结合，一个能与被亲和分子结合。配基的固定化方法有载体结合法、物理吸附法、交联法和包埋法等四类方法。常用的配位体如下：

1）三嗪染色剂，用于蛋白质的纯化；

2）酶的底物或偶联因子，用于特定酶的纯化；

3）抗体，用于相应的抗原；

4）蛋白质A，用于IgG抗体的纯化；

5）单链寡核苷酸，用于互补的核酸如mRNA，或特定的单链DNA序列；

6）凝集素，用于特定的单糖亚基。

亲和层析的基本操作如下：

1．寻找能被分离分子（称配体）识别和可逆结合的专一性物质——配基。

2．把配基共价结合到层析介质（载体）上，即把配基固定化。

3．把载体－配基复合物灌装在层析柱内做成亲和柱。

4．上样亲和→洗涤杂质→洗脱收集亲和分子（配体）→亲和柱再生。