在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与众不同波长相对应的吸收强度。如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。它们与比色法一样，都以Beer-Lambert定律为基础。

近年来，紫外及可见光分光光度分析已得到广泛的应用，它不仅可以用于物质的鉴定及结构分析，而且还可以用于某些物质含量的测定。

分光光谱技术可用于：

1)      通过测定某种物质吸收或发射光谱来确定该物质的组成。

2)      通过测量适当波长的信号强度确定某种单独存在或与其他物质混合存在的一种物质的含量。

3) 通过测量某一种底物消失或产物出现的量同时间的关系，追踪反应过程。

  一、紫外及可见光分光光度法

这是一种只在可见光及紫外光光谱应用范围内测量物质吸收辐射线的技术，应用十分广泛。其中分光光度计可用于精确测量特定波长的吸收值，而比色计则是一种较简单的测量仪器，其原理是利用虑光片来测量较宽波段（如可见光中的绿光、红光或蓝光范围）的吸收值。

光吸收法则：

溶液对光的吸收有两个基本法则：

1)      透过溶液的光的吸收值同吸收溶质的分子数目（即溶质浓度[C]）呈指数相关。

2)      透过溶液的光的吸收值同透过吸收溶液的路径长度l成指数相关。

这两条法则包括在比尔－朗伯关系式中。通常以入射光（Io）和出射光（I）的光密度来表示：                

                            Log₁₀(Io/I)=εl[C]

其中ε对于吸收物质及波长是一个常数，称为吸光系数或吸收系数，[C]的单位为mol/L或g/L，l的单位为ml。这一公式非常有用，因为大多数分光光度计设计为直接测量log₁₀(Io/I)的值（A）或消光值（E）（旧教材中可能使用以废除的术语：光密度）。对于遵循比尔－朗伯关系的物质，A与C呈线性关系。吸收值常用下标表示其波长，如A₅₅₀表示550nm处的吸收值。透过溶液的光的比例称为透光率（T），可由出射光和入射光的比值求得。

吸收值（A）（absorbance）——由公式得出：A= Log₁₀(Io/I)

透光率（T）（transmittance）——通常以百分数表示：T=(I/Io)×100%. 

（一）比色计

比色计用于测定颜色明显，并且是溶液主要组分的待测物，如血液中的血红细胞，也可以在待测物之中加入一种试剂，使其形成有色产物（一种生色团），如用茚三酮法测定氨基酸含量。定量分析某种物质要做标准曲线，标准曲线是在测定待测样品的同时测定已知含量的物质来制成的，而不是使用比尔－朗伯关系。

光源通常为钨丝灯泡，通过一个凸透镜聚焦后产生一束平行光，平行光穿过装有溶液的玻璃样品或小池，然后透过一个有色滤光片到达光电管检测仪，检测仪产生一个同落在光电管上的光密度成正比的电势，来自于光电管的信号被放大然后传递到电流计或数字读数器。

比色计的使用：

①接通电源使仪器稳定，使用前至少要让灯预热5min；② 选择一种同底物颜色互补的滤光器；③调零（用空白对照调零）；④调整灵敏度；⑤分析样品及标准溶液；⑥由于不同比色杯的吸光特性、杯壁厚度不同，因此为了提高精确度，同一试验应用同一比色杯，且在比色槽中摆放的方位相同；⑦每次测样前清洗比色杯；⑧经常重复测定同一溶液检验比色计的可重复性；⑨用标准溶液绘制标准曲线。

由于大多数过滤器过滤出来的光的波带很宽，因而比色计既不能用于确定某种复合物，也无法分辨在混合液中吸收特性非常相近的两种物质。比色计所用光电管的变化系数为0.5%左右，因而不适合要求具有高度精确性的工作。使用这种最简单的仪器，由于仪表上对数测量刻度单位的随意性，即使是把表上的灵敏度/刻度调节到零控点，在一个仪器上获得的值不可直接同另一台仪器上测得的值相比较，同一仪器的不同设置之间也不可直接比较。比色计对于特定波长的量化工作是不合适的。

（二）紫外光/可见光分光光度计

紫外光/可见光分光光度计基本装置中采用高强度的钨灯作为光源，能够在可见光范围（400~700nm）调节。氘灯用于紫外分光光度测量（200~400nm）；使用氘灯时要用石英杯，因为紫外线不能透过玻璃。

分光光度计之所以优于比色计就在于使用了一个衍射光栅将光源的复色光转换为单色平行光束。实际上从这种单色一种产生的光不是某个波长的光，而是一段窄的带宽上的光，带宽是分光光度计的一个重要特性，这是由于它决定了吸收测量中所用的波长——普通分光光度计的带宽为5~10nm，用于研究的仪器的带宽小于1nm。

因为光栅夹缝的宽度影响着带宽，带宽随光栅夹缝的宽度的减少而降低，要获得特定波长下的精确数据，尽可能使用最小的缝宽度。然而，减少了缝宽也会减少到达监测器的光度，降低了信/噪比。缝宽可减少的程度取决于检测/放大系统的灵敏度及稳定性于离散光的存在。

大多数UV/可见光分光光度计使用的比色杯的光穿过路径为10nm。一次性塑料杯适合于对水和乙醇溶液在可见光范围内的测量。玻璃比色杯的生产要求更加严格的标准，因而在精确研究中要使用玻璃比色杯，尤其当溶液的吸收值很低时（<0.1），即使盛对照液与待测样品液的比色杯在光学性质上有稍许不同，也会导致结果偏差。玻璃和塑料会吸收UV光，因此在测波长小于300nm的吸收值时要使用石英杯。

进行测量之前，比色杯要保证干净，无划痕，外表面干燥，盛液到适当高度，并放在了比色槽中的正确位置。生物样品中蛋白质和核酸可能会在玻璃/石英杯的内表面沉积，因而要用棉球沾上丙酮擦去比色杯内的沉淀或用1mol/L硝酸浸泡过夜。腐蚀性及毒性溶液必须使用有盖子的比色杯，以防止溅出，破坏仪器。

基本分光光度计使用的光电管类似于比色计中所使用的光电管。许多情况下，当波长高于和低于550~600nm时必须使用不同的光电管，这是因为它们在可见光波长内的灵敏度不同，更精彩的仪器中所使用的是具有比光电管更高的灵敏度和稳定性的检测器。数字显示由于不易产生视觉错误和误读范围的错误，正逐渐代替指针读数。一些仪器可以直接给出所测定物质的浓度。

1．紫外光/可见光分光光度计的类型：

基本分光光度计只产生单束光。这种仪器首先用空白对照调到零吸收值，然后取出空白液，加入待测液，测定待测液的吸收值。也有一种双束分光光度计，有单色光源产生的光束被分为两束，一束穿过待测液，另一束穿过空白液。吸收值由一个电子线路通过对比透过待测液及空白液的出射光进行测定。双光束分光光度计减少了由于光源输出的不稳定或检测系统灵敏度的变化而导致的测量错误，这时由于待测液与对照液是同时进行测量的。记录式分光光度计是一种双束测定仪，用于记录已知波段下吸收值随时间的变化（如用于酶分析）。

2．分光光度计的定量分析：

假如已知一种物质在某一波长下的吸光率（通常是该物质的最大吸收值，这时灵敏度最高），这种物质纯溶液的浓度可用比尔－朗伯关系式算出。摩尔吸光系数是指物质在1mol/L的浓度下，比色杯厚度为1cm时的吸收值。该值可以从光谱数据表中查到，也可以用实验方法通过测量一系列已知浓度的物质的吸收值来绘制一条标准曲线。这样，在所要求的浓度范围内，便可确定吸收值与浓度之间存在的线性关系，该直线的斜率即为摩尔吸光系数。

比吸光率是指物质质量溶液浓度为10g/L时，比色杯厚度为1cm时测定的吸光值。该值对于未知分子质量的物质如蛋白质核酸的测定很有用，这种情况下溶液中物质的含量以其质量表示而不用摩尔浓度表示。使用公式Log₁₀(Io/I)=εl[C]时，比吸光率要除以10才可以得到一个以g/L为单位的浓度值。

这种简单的方法不能用于测定混合样品。在这种情况下，也许可以通过测量几个波长下的吸光度来估算每种成分的含量，如可用此方法在核酸存在下进行蛋白质含量的估算。

分光光度计的使用方法：

（1）接通电源；（2）使用前预热15min；（3）选择波长；（4）选择检测器；（5）如果可能的话，选择正确的缝宽；（6）插入适当的空白对照；（7）调解到0%的透过率；（8）将吸光值调到零；（9）分析样品；（10）每测量10个样品后，用空白对照校验零刻度；（11）检测仪器的可重复性。

二、荧光光谱分析

当紫外光照射某一物质时，该物质会在极短的时间内，发射出较照射波长为长的光。而当紫外光停止照射时，这种光也随之很快消失，这种光称为荧光。荧光是一种光致发光现象。如前所述，分子吸收了某一波长区的辐射能后，它的电子可跃迁至激发态，然后以热能形式将这一部分能量释放出来，本身又恢复到基态。如果吸收辐射能后处于电子激发态的分子以发射辐射的方式释放这一部分能量，即为光至发光。再发射的波长与分子所吸收的波长可以相同，也可以不同。物质所吸收光的波长和发射的荧光波长与物质分子结构有密切关系。同一种分子结构的物质，用同一波长的激发光照射，可发射相同波长的荧光，但其所发射的荧光强度随着该物质浓度的增大而增强。利用这些性质对物质进行定性和定量分析的方法，称为荧光光谱分析法，也称为荧光分光光度法。这种方法具较高的选择性及灵敏度，试样量少，操作简单，且能提供比较多的物理参数，现已成为生化分析和研究的常用手段。

1. 荧光的产生及其与分子结构的关系：

1) 荧光的产生：

当光进入某种物质后，可以有两种情况：一种是进入物质后，能量几乎不被吸收；另一种是能量被全部或部分吸收。在后一种情况下，在吸收光的过程中，光能被转移给分子。根据量子理论，分子从光波中吸收能量是不连续的、整份单位的形式发生，这些不连续的微小能量单位被称为光量子。这也就是说，频率n的单色光的能量必定是hn的整数倍。每个光量子的能量

E=hn=hc/λ=hcω,

这里，h为普朗克常数，6.63×10^－34J/s；ω为波长，即1cm长度中电磁波的数目。从公式可见，能量E与λ成反比。

每个分子具有一系列分子的能级，处于基态的分子吸收了相应频率的能量后，可以从低能级跃迁到高能级。被吸收的光量子的能量正好等于两个能级之差。

根据玻尔兹曼分布，分子在室温时基本上处于电子的基态。吸收了紫外－可见光后，基态电子只能跃迁到单线激发态的各个不同的震动能级。跃迁后能量较大的激发态分子，在很短时间内（10—15s），由于分子间的碰撞或分子与晶格间的相互作用，以热能形式或内转换方式消耗部分能量，从较高震动能级回到最低震动能级。如果这时分子不通过热能或内转换形式来消耗能量，回到基态，而是通过发射出相应的光量子来释放能量，回到基态的各个不同震动能级时，就发射荧光。由于在发射荧光前已有一部分能量消耗，所以发射荧光能量要比吸收紫外光的能量小，也就是荧光的特征波长比吸收的特征波长要长。

2) 荧光与分子结构的关系：

在许多有机物和无机物中，只有小部分物质会发生强的荧光，它们的激发光谱、发射光谱及荧光强度与它们的结构有密切的关系。强荧光物质在分子结构上往往具有如下特征：

a. 具有大的共轭π键结构：共轭体系越大，离域π电子越容易激发，越容易产生荧光。大部分荧光物质都有芳香环或杂环。芳香环越大，其荧光峰移向波长方向，且荧光强度也往往较强。具有相同共轭环数的芳香族化合物，线性环结构者的荧光波长比非线性者长。

b. 具有刚性平面结构：荧光量子产率高的荧光物质，其分子多为平面构型，并具有一定的刚性。

c. 具有最低的单线电子激发态S₁为π，π₁型。

d. 取代基团为给电子取代基。芳香烃及杂环化合物的荧光光谱和荧光量子产率常随取代基的变化而变化。若取代基为给电子取代基，则荧光强度增加。属于这一类基团的有—NH₂，—NHR，—NR₂，—OH，—OR，—CN。

2. 荧光分光光度计：

荧光分析从入射光的直角方向、黑背景下检测样品的发光信号，这与紫外分光光度法从入射光方向、在亮背景下检测光吸收信号相比，具有更高的灵敏度。此外荧光分析在检测器前面是发射单色器，样品信号经过分光后可以去除样品以外的辐射，从而为方法的专一性提供了有力的条件。

用于测量荧光的仪器种类很多，如荧光分析灯、荧光光度计、荧光分光光度计及测量荧光偏振的装置等。其中实验室里常用的是荧光分光光度计。

荧光分光光度计的结构包括五个基本部分：

1)      激光光源：用来激发样品中荧光分子产生荧光。常用汞弧灯、氢弧灯及氘灯等，目前荧光分光光度计以用氘灯为多。

2)      单色器：用来分离出所需要的单色光。仪器中具有两个单色器：一是激发单色器，用于选择激发光波长；二是发射单色器，用于选择发射到检测器上的荧光波长。

3)      样品池：放置测试样品，都用石英做成。

4)      检测器：作用是接受光信号，并将其转变为电信号。

5)      记录显示系统：检测器出来的电信号经过放大器放大后，由记录仪记录下来，并可数字显示和打印。 

3. 荧光分析法：

荧光分析方法根据不同的目的性，有多种分析方法，诸如同步荧光测定、三维荧光光谱技术、导数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分辩荧光测定、荧光偏振测定、低温荧光测定、荧光免疫检测等等，各种不同的分析方法在仪器配置上常需要添加相应的配件。这些方法在此不作详细叙述，只讨论常规的荧光分析法。

1) 直接测定法和间接测定法：

利用荧光分析法对被分析物质进行浓度测定，最简单的便是直接测定法。某些物质只要本身能发荧光，只须将含这类物质的样品作适当的前处理或分离除去干扰物质，即可通过测量它的荧光强度来测定其浓度。

有许多物质，它们本身不能发荧光，或者荧光量子产率很低仅能显现非常微弱的荧光，无法直接测定，这时可采用间接测定方法。

间接测定方法有以下几种：

a. 化学转化法： 通过化学反应将非荧光物质转变为适合于测定的荧光物质。例如，金属离子与螯合剂反应生成具有荧光的螯合物。有机化合物可通过光化学反应、降解、氧化还原、偶联、缩合或酶促反应，使它们转化为荧光物质。

b. 荧光淬灭法： 这种方法是利用本身不发荧光的被分析物质所具有使某种荧光化合物的荧光淬灭的能力，通过测量荧光化合物荧光强度的下降，间接的测定该物质的浓度。

c. 敏化发光法： 对于很低浓度的分析物质，如果采用一般的荧光测定方法，其荧光信号太微弱而无法检测。在此种情况下，可使用一种物质（敏化剂）以吸收激发光，然后将激发光能传递给发荧光的分析物质，从而提高被分析物质测定的灵敏度。

以上三种方法均为相对测定方法，在实验时须采用某种标准进行比较。 

2) 多组分混合物定量法：

在荧光分析中，由于每种荧光化合物具有各自的荧光激发光谱和发射光谱，因而在测定时相应的有激发波长和发射波长两种参数可供选择，这在混合物的测定方面比分光光度法具有更有利的条件。

当混合物中各个组分的荧光峰相距很远，彼此干扰很小时，可分别在不同的发射波长测定各组分的荧光强度。若混合物中各组分的荧光峰很靠近，彼此严重重叠，但他们的激发光谱却有显著的差别，这时可选择不同的激发波长进行测定。

在选择激发波长及发射波长之后，仍无法达到混合物中各组分的分别测定时，则可利用荧光强度的加和性质，在适宜的荧光波长处，测得混合物的荧光强度，再根据被测组分各自在该波长下的最大荧光强度，仿照分光光度法列出联立方程，求得各组分的含量。