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DNA指纹图谱分析
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发布时间：2007-11-25
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一. 实验目的
1. 掌握DNA指纹图谱技术的概念、原理和基本操作过程
2. 学习DNA的限制性酶切的基本技术
3. 掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术，学习利用琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段的长度，并能对实验结果进行分析。
二. 实验原理
1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA用作基因探针，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为"DNA指纹"，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。DNA指纹的图像在X光胶片中呈一系列条纹，很像商品上的条形码。DNA指纹图谱，开创了检测DNA多态性（生物的不同个体或不同种群在DNA结构上存在着差异）的多种多样的手段，如RFLP（限制性内切酶酶切片段长度多态性）分析、串联重复序列分析、RAPD（随机扩增多态性DNA）分析等等。各种分析方法均以DNA的多态性为基础，产生具有高度个体特异性的DNA指纹图谱，由于DNA指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为目前最具吸引力的遗传标记。
DNA指纹具有下述特点：1．高度的特异性：研究表明，两个随机个体具有相同DNA图形的概率仅3×10－11；如果同时用两种探针进行比较，两个个体完全相同的概率小于5×10－19。全世界人口约50亿，即5×109。因此，除非是同卵双生子女，否则几乎不可能有两个人的DNA指纹的图形完全相同。2．稳定的遗传性：DNA是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现，DNA指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的图谱中找到，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递50％给子代。3．体细胞稳定性：即同一个人的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等产生的DNA指纹图形完全一致。
DNA指纹图谱法的基本操作：从生物样品中提取DNA（DNA一般都有部分的降解），可运用PCR技术扩增出高可变位点（如VNTR系统，串联重复的小卫星DNA等）或者完整的基因组DNA，然后将扩增出的DNA酶切成DNA片断，经琼脂糖凝胶电泳，按分子量大小分离后，转移至尼龙滤膜上，然后将已标记的小卫星DNA探针与膜上具有互补碱基序列的DNA片段杂交，用放射自显影便可获得DNA指纹图谱。
琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化DNA片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料-溴化乙锭进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。如有必要，还可以从凝胶中 回收DNA条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kbp的DNA。长度100kb或更大的DNA，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。
在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。DNA分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。
三. 实验材料和试剂
1. DNA样品：犯罪现场DNA样品（CS）、嫌疑犯1 DNA样品（S1）、嫌疑犯2 DNA样品（S2）、嫌疑犯3 DNA样品（S3）、嫌疑犯4 DNA样品（S4）、嫌疑犯5 DNA样品（S5）
2. 化学试剂和溶液
（1） DNA样品反应缓冲液：100mM Tris, 200mM NaCl, 20mM MgCl2, 2mM DTT, pH 8.0。
（2） EcoRⅠ限制性内切酶
（3） PstⅠ限制性内切酶
（4） 电泳缓冲液 （50×
4） TAE
Tris 242g
冰醋酸 57.1ml
EDTA（0.5mol/L pH 8.0） 100ml
使用时用蒸馏水稀释50倍。
（5） 样品缓冲液（DNA sample loading dye）
0.25%溴酚蓝
0.25%二甲苯青
40%（W/V）蔗糖
（6） 溴化乙锭（EB） 10mg/ml
（7） 琼脂糖agarose（电泳级）
（8） DNA分子量标记物：Lambda HindⅢ DNA markers
3. 仪器设备和消耗品
电泳仪、电泳槽、样品梳、微波炉、水浴锅、移液器（10μl，200μl，1000μl）、离心管、一次性枪头（200μl，1000μl）。
四. 实验步骤
1. DNA样品的制备
采集生物检测样本，在弱碱和螯合剂存在条件下进行组织匀浆，溶解细胞或细胞核膜；利用阴离子去垢剂和蛋白酶，在37孵化数小时，消化蛋白质分离DNA；使用有机溶剂如苯酚、氯仿等除去残余蛋白质，萃取DNA；用乙醇或某些盐类从溶液中沉淀DNA。
由于一般采集的样本中的DNA都有不同程度的降解，采用PCR技术扩增出完整的基因组DNA或者特定的高可变位点，以此制备出的DNA样品备用。
2. DNA样品的酶切反应
设置DNA样品的双酶切反应，按下列顺序加样（体积：μl）：
反应管 对照管
样品DNA 10 10
反应缓冲液（10×） 2 2
双蒸水 6 8
EcoRⅠ 1
0
PstⅠ 1 0
总体积 20 20
加完反应液，温和混匀，置于37℃水浴中反应1小时，取出备用。
3.酶切产物的琼脂糖电泳
（1）在100ml电泳缓冲液（1TAE或0.5TBE）中加入1g琼脂糖，加热熔化，注意观察，当心煮沸的液体，溢出！。当凝胶冷却至60℃左右时加入5ul溴化乙锭溶液（终浓度为1ug/ml），充分混匀。
（2）先用透明胶带封固胶托边缘，放好梳子，然后再倒入凝胶（凝胶厚度在5mm左右）。
（3）在凝胶完全凝固后（室温放置30-45分钟），小心移去梳子和透明胶带，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液（液面超过胶带约2-3mm）。
（4）取已制备好的酶切DNA样品，加入1/5样品缓冲液，充分混匀。用移液器将样品小心地加入点样孔。在不同的点样孔中，分别加入DNA分子量标记物，对照以及酶切DNA样品各5-10ml。
（5）盖上电泳槽，打开电源并调节电压（通常用50-100伏），电泳40-60分钟（注意：DNA样品从负极向正极泳动）。
4. 结果观察与分析
关闭电源，取出凝胶，在紫外灯下观察DNA的迁移位置，并讨论实验结果。判断CS与哪一个DNA样品是同一个样品，找出罪犯。
五. 注意事项
（1）酶切时，应尽量减少反应中的加水量以使反应体系减到最小。但要确保酶体积不超过反应总体积的十分之一，否则限制酶活性将受到甘油的抑制。
（2）进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后再从冰箱中取出酶，并应放置于冰上。每次取酶时都应换一个无菌吸头 。操作要尽可能快，用完后立即将酶放回冰箱。
（3）溴化乙锭是一种强烈的致癌物质，使用时必须带手套 。实验结束后，含溴化乙锭的凝胶要进行净化处理。
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