一、试验目的 1.初步掌握用秋水仙素诱发多倍体的方法。 2.了解植物多倍体细胞染色体加倍的特点,观察染色体加倍后的细胞学表现,准确判断多倍体细胞。 3.了解人工诱发多倍体植物的原理、方法及其在植物育种上的意义。
二、实验原理
自然界中各种生物的染色体数目一般是相对稳定的,这是物种的重要特征。某种生物的完整的一套单倍染色体组或基因组(genome)。在同一染色体组内各染色体形态不同,携带了物种全套遗传物质,每个染色体组所包含的染色体数目称为基因数(以X表示)。例如,玉米有20条染色体,X=10。凡是细胞核内具有一套完整染色体的个体叫单倍体,以n表示。具有两套染色体组的个体称为二倍体,以2n等。
除了自然界存在的多倍体物种之外,利用一些诱发因素可以人工诱导植物产生多倍体,主要方法有两种:物理方法(如高温、低温、高速离心力、X射线照射、嫁接和切断等)及化学方法(如植物碱、植物生产激素、水合三氯乙醛、笑气、富民隆等药剂)处理。化学方法中最为有效的和最常用的是秋水仙素,首次使用于1937年。秋水仙素是由百合科植物秋水仙的种子及器官中提取出来的一种剧毒生物碱,化学分子式为C22H25NO6。纯品为无色或淡黄色针状结晶,熔点155℃,有苦味,易溶于冷水、酒精、氯仿和甲醛。通常使用水或酒精作溶媒,具有麻醉作用,对植物种子、幼芽、花蕾、花粉和嫩枝等可产生诱变作用。
秋水仙素的主要作用机理是抑制微管的聚合过程和纺锤体的形成,使染色体不走向两级而被阻止在分裂中期,导致细胞不能继续分裂,从而产生染色体数目加倍的核,但对染色体结构无明显的影响。若加倍后的细胞恢复分裂就形成多倍体组织。由多倍体组织分化产生的性细胞,所产生的配子是多倍体,因而可以通过有性繁殖方法把多倍体繁殖下去,这是体细胞分生组织染色体加倍的起源方式。另外,如在配子形成过程中,细胞减数分裂受到秋水仙素的抑制后,配子变为二倍性,雌雄配子结合后,也产生多倍体,这是配子染色体未减数的起源方式。秋水仙素诱导只能产生多倍体,且为同源多倍体,而有性杂交可产生奇数多倍体、异源多倍体。
秋水仙素诱发多倍体的方法主要有浸渍法、涂抹法、滴液法、喷雾法等,处理时间因作物种类和施用部位不同而异,几分钟到几十天不等,常用浓度为0.01~1%。染色体加倍后对性状的影响是随基因型与环境条件而异,无固定模式可寻。一般在同源多倍体中(4X~6X)细胞与器官增加的倾向,而到高阶多倍体有时反而缩减。就植物营养体来说,单倍体比二倍体生长差,三倍体和四倍体较好或接近于二倍体;就种子器官来说,四倍体比二倍体大;对有性生殖来说,凡倍性是单数的都将因减数分裂受到干扰而不育,但如果变成异源多倍体,则由于杂种优势而育力加强,可育率也会增高。
染色体加倍后必须进行鉴别。同源多倍体主要是根据形态特征性来判断。如叶色、叶形及气孔和花粉粒的大小,凡较对照较大者多有可能为多倍体,此为间接鉴定。最为可靠的方法进行染色体直接鉴定,即取植物根尖细胞、嫩叶细胞或花粉母细胞制片选适当的染色剂,用涂抹法或压片法观察诱变材料,确定其染色体的倍数。
多倍体已经成功应用于植物育种,可以得到一般二倍体所没有的优良经济性状,如粒长、穗长、抗病性等。三倍体西瓜、三倍体甜菜、八倍体小黑麦等已经在生产上应用。人工诱发多倍体还可以用于解决远缘杂交不孕性和远缘杂交不育性的困难。
本实验用适当浓度的秋水仙素处理洋葱根尖,待根尖膨大后制片观察,可发现多倍体细胞。 三、实验试剂及用具 1、试剂: 1)0.4%秋水仙素溶液的配制:称取0.4g秋水仙素,用少许无水乙醇助溶,加蒸馏水并定容为100ml。 2)卡诺氏(Carnoy)固定液:冰醋酸/无水乙醇(1/3,V/V) 3)解离液:1mol/L HCl 4)醋酸洋红染色液:将1g洋红与100ml45%的冰醋酸混合后煮沸,煮时可加入锈铁钉一枚以增加染色效果,保存备用,用时过滤。
2、仪器及用具:显微镜、恒温水浴锅、电子天平、剪刀、镊子、解剖刀、盖玻片、载玻片、培养皿、洗瓶、试剂瓶、酒精灯等。
四、实验材料 洋葱(Allium cepa)或种子
五、实验方法及步骤 1、培养 1)根尖处理:洋葱刮去老根,放在小烧杯上,加水至刚与根部接触为止,当洋葱新根长至0.5~1.0cm左右时,将上述烧杯中的清水换成含有0.4%秋水仙素水溶液,培养24h。 2)种子处理:0.1%秋水仙素浸泡种子24h后,0.25%秋水仙素20~25℃湿润保持48h。
2、将根尖或种子反复置于清水中冲洗,以降低残留,避免生理损伤。
3、1)固定:采用渗透力强的固定液将植物组织、细胞迅速杀死,使蛋白质沉淀,使植物细胞保持原有状态。 固定方法:将植物材料用蒸馏水冲洗2~3次后转移到卡诺氏(Carnoy)固定液中固定3~24h。如果固定后的材料不立即使用,可放在70% 酒精中,置于冰箱或阴暗处保存。用时在用固定液重新固定一下。 2)解离:根尖需经过解离除去细胞间的果胶层并使细胞壁软化,确保压片步骤顺利进行,常用酸解法,另外还会使用酶解法和乙醇、浓盐酸混合液处理方法解离根尖。 酸解法:固定后的材料用清水冲洗,放入1mol/L的HCl中60℃处理5~10min。注意掌握好温度和时间。若解离时间不够、则压片不易分散;解离时间过长,则下一步处理时由于材料过软而将根尖丢失。 3)染色:常用染料为:洋红(carmine)、碱性品红、Shiff试剂、苏木精等。本实验采用醋酸洋红染色。洋红是从雌性胭脂虫中直接提取的一种非结晶的紫褐色染料。染色活性物质是洋红酸。 解离后的材料用蒸馏水冲洗,将根冠和伸长区切除,只留分生区部分然后将根尖置于载玻片上,加一滴染色液,放置5~10min,可视具体情况适当延长染色时间。 4)压片操作 染色完毕后加上盖玻片,在酒精灯火焰上过3~4次,以手背试之,玻片感觉微烫为宜。这一步是使材料更易软化和着色,并破坏部分细胞质染色使背景清晰。如果室内气温较高或认为染色效果较好,可以不做此步骤。 压片方法:用左手拇指压住盖片的一角,用右手拿铅笔上的橡皮垂直敲盖片几下,把材料震散,注意用力要均匀。继续用左手拇指压住盖片,在保证两玻片不错动的情况下,将材料压成薄薄的一层,即可放在显微镜下观察。 5)镜检:压好的片先在低倍镜下镜检,找到分裂细胞后,在转换成高倍镜观察染色体的动态变化。如果染色体分散良好,图像清晰,就可以脱水封片,制成永久片。
六、实验结果: 结果分析:在实验中,没有看到明显的染色体加倍的结果,只看到模糊的染色体。原因估计是染色和压片这两步做得不太好,增加染色的时间,使染色体能够充分着色;在压片时应该把材料尽量压得分散些,使细胞分离出来,才能更好地辨认出染色体的形态。
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