5)PCR
实验条件 50mmol/L KCI、10mmol/L Tris-HCI(20℃pH8.3)、1.5mmol/LMgCl2、明胶(10μg/ml)、0.8mmol/LdNTPs(每种0.2mM)、 2μM引物(每一引物1μM)和TaqDNA多聚酶(50U/ml)。
PCR周期 PCR前，用紫外线(UV)(254nm)照射上述反应混合物，然后将之加入到微滴板孔中，每孔40μl，再加20μlUV照射的石蜡覆盖，按下述温度在 PCR仪上进行PCR周期:起始变性94℃5min;30个周期:变性94℃5min，退火58℃1min，延伸72℃1min，最后延伸72℃ 5min，得到的PCR产物为特定的261bp的片段。
参考流程
1. 用0.85% NaCl将细菌溶液稀释至一定浓度。
2. 加50μl于微孔板内，4℃过夜。同时设阴性对照（加50μl 0.85% NaCl于另一孔内）。
3. 用400μl的0.05% 温20pBS（以下简称TPBS），洗涤五次。
4. 加入2.25%的100μl正常山羊血清(NGS) PBS封闭2小时.
5. 用含0.15% NGS的TPBS洗3次.
6. 加入100μl用0.75% NGS适当稀释的单克隆抗体(内含100μg的鲜鱼精DNA),室温孵育30min.
7. 用TPBS洗涤五次.
8. 加入50μl适量稀释的生物素化抗鼠IgG抗体,室温孵育30min.
9. 用TPBS洗涤五次.
10.加入60μl适量稀释的生物素化DNA和亲和素,室温孵育30min.
11.用TPBS洗涤五次,再用HPLC级水洗三次.
12.PCR扩增:加入50μl PCR反应液(内含T3和T7引物),95℃ 60sec,50℃ 110sec,72℃ 110sec,循环30次.取PCR产物10μl于1.7%琼脂糖凝胶上电泳,和核酸分子量标准相比较,在相应的位置邮现电泳带为阳性.必需时将电泳结果照像,进行定量分析.
3 PCR产物的检测与定量技术
1）凝胶检测系统 用凝胶扫描仪或计算机辅助视频设备对溴化乙锭染色的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶进行定量，放射性标记的扩增产物可通过放射自显影定量测定，最近用自动DNA 测序仪检测荧光标记的核酸，这种方法可准确测量扩增产物的大小，而且其检测灵敏度达fg水平，但由于自动DNA序列仪和荧光标记引物极为昂贵，所以现在仅用于研究。
2）HPLC检测系统 此法的优点为PCR产物不用纯化，对未标记的产物灵敏度可达fg水平，对标记产物的检测限度可能更低。HPLC能区分不同分子的大小，可允许我们使用不同大小的内标衡量扩增的效率。
3） 固相测定系统 最常用的为96孔聚苯乙烯微量滴定板，可用仪器比色或读数，可用亲合素分子通过疏水相互作用包被滴定板，此固相系统可特异结合生物素或生物素化的分子可用于生物素化的PCR产物的定量，如用生物素和地高辛双重标记的扩增产物可用微量滴定板法定量，将生物素和地高辛同时标记PCR产物的方法有三种途径:①在反应混合物中同时加入地高辛和生物素标记的脱氧核苷酸类似物(DIG-/Bio-dUTP);②加入生物素化的引物1和DIG-dUTP;③加入生物素引物1和地高辛标记的引物2。定量方方法为:双重标记的扩增产物用乙醇沉淀以去除未结合的标记物，然后加至亲合素包被的微量滴定板上温育至少2小时，洗涤数次后，与DIG抗体:AP结合物温育，根据其底物不同可产生不同的颜色，亲合素介导的固相捕获生物素标记靶分子的技术是一个有效、灵活和容易操作的技术，将成为定量PCR的一个关键技术。
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