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推荐:PCR实验技术指南
文章来源: 文章作者: 发布时间:2006-11-22   字体: [ ]  
 

3、防止污染的方法
(一)合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR 反应液、PCR 循环扩增及PCR 产物的鉴定等步骤分区或分室进行,特别注意样本处理及PCR 产物的鉴定应与其它步骤严格分开.最好能划分①标本处理区;②PCR 反应液制备区;③PCR 循环扩增区;④PCR 产物鉴定区. 其实验用品及吸样枪应专用.实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA 或RNA.
(二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题.由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源,因而加样或吸取模板核酸时要十分小心,吸样要慢,吸样时尽量一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或产生气溶胶污染.
(三)预混和分装PCR 试剂:所有的PCR 试剂都应小量分装,如有可能,PCR 反应液应预先配制好,然后小量分装,-20℃保存.以减少重复加样次数,避免污染机会.另外,PCR 试剂,PCR 反应液应与样品及PCR 产物分开保存,不应放于同一冰盒或同一冰箱.
(四)防止操作人员污染,使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用.
(五)设立适当的阳性对照和阴性对照,阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜,并注意交叉污染的可能性,每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照.
(六)减少PCR 循环次数,只要PCR 产物达到检测水平就适可而止.
(七)选择质量好的Eppendorf 管,以避免样本外溢及外来核酸的进入,打开离心管前应先离心,将管壁及管盖上的液体甩至管底部.开管动作要轻,以防管内液体溅出.
4、PCR 污染解决对策(这是从另一篇文章总结而来,与前面的部分略有重复,大家随便看看吧)PCR 检测微量感染因子时,一定要注意产物残留污染的问题。
 
一. 污染的预防
进行PCR 操作时,操作人员应该严格遵守一些操作规程,最大程度地降低可能出现的
PCR 污染或杜绝污染的出现。
(一)划分操作区:目前,普通PCR 尚不能做到单人单管,实现完全闭管操作,但无论是否能够达到单人单管,均要求实验操作在三个不同的区域内进行,PCR 的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行:
1. 标本处理区,包括扩增摸板的制备;
2. PCR 扩增区,包括反应液的配制和PCR 扩增;
3. 产物分析区,凝胶电泳分析,产物拍照及重组克隆的制备。
各工作区要有一定的隔离,操作器材专用,要有一定的方向性。如:标本制备→PCR扩增? 产物分析? 产物处理。
切记:产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。
(二)分装试剂:PCR 扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中,不能用来吸取扩增后的DNA 和其他来源
的DNA:
1.PCR 用水应为高压的双蒸水;
2.引物和dNTP 用高压的双蒸水在无PCR 扩增产物区配制;
3.引物和dNTP 应分装储存,分装时应标明时间,以备发生污染时查找原因。


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