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RT-PCR在检测HCV中的应用
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发布时间：2006-11-22
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3）.非结构蛋白基因区:该区编码的蛋白不是病毒颗粒的构建成份，它主要与病毒的复制有关，它们分别是NS1、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a、NS5b，等7种蛋白，是由非结构前体蛋白经病毒本身产生的蛋白酶切割与修饰而形成的.NS1位于HCVRNA的第390～729(1450-1519nt)位密码子区，有的学者认为NS1应属结构区基因，与E1共同编码HCV外膜糖蛋白，故也称为E2，现在文献中多写成NS1/E2.该段基因编码一个含340个氨基酸的蛋白，分子为38KDa，NS1/E2区和E1一样，具有较大的变异性，根据NS1/E2碱基序列的同源性可将HCV分为2个类型，即HCV1和HCV2.HCV1型在NS1/E2外膜糖蛋白gP72的氨基端有一段长约26个氨基酸的区段(386-411位密码子区)是一个超变区(HVR1);而在HCV2型中，除了存在HVR1区外，还有一个高变区HVR2，位于474-480位密码子之间.HCV所有分离株在HVR的序列均不相同，且HVR1比HVR2更易变异.Kato等于不同时间连续地对2例慢性丙型肝炎病人HCV的HVR1和HVR2序列变异率分析发现，HVR1平均每月有一个氨基酸改变.这些超变区在HCV生物学上的真正意义还不清楚，但可推测它们的存在与HCV容易逃避机体免疫系统的“监控”有很大关系.NS2位HCVRNA基因组的第730-1006位密码子区(1520～3350nt).编码一个含有277个氨基酸的蛋白，该蛋白含有较多的疏水氨基酸.因此具有较强的疏水性，其功能可能与膜结合作用有关.NS3位于HCVRNA基因组的第1007-1615位密码子区(3351-5177nt)，编码一个含60个氨基酸的蛋白，该区变异性较小，与RNA解旋酶的表达有关.NS3蛋白含有较强的优势抗原表达区，不仅没有型特异性，而且相应的抗体出现较早，反应性也较强.因此NS3抗原和C抗原一样，是第二代抗HCV诊断试剂的必需抗原成份.NS4位HCVRNA基因组1616-2013位密码子区(5178-6371nt)，编码一个由398个氨基酸组成的蛋白，经水解成为两个蛋白:NS4a(1616-1862)和NS4b(1863-2013).该区编码的蛋白有较好疏水性，可能与膜结合有关.NS5位于HCVRNA基因组的2014-3010位密码子区(6372-9362nt)，编码一个含997个氨基酸残基的蛋白，该区有较高的保守性，是依赖于RNA的RNA聚合酶基因区，与病毒复制有关.通过真核表达和体外翻译系统表明:NS5区至少裂解为两个蛋白，它们是NS5a区的56KD蛋白和NS5b区的66KD蛋白，前者溶于水，后者不溶于水.保守的氨基酸序列GDDRNA聚合酶区就位于66KD的NS5，56KD的NS5b区还在病毒的复制中起作用，可能是复制复合物的成份.NS5a还可能与NS4b和NS5a之间的裂解有关.经核苷酸和氨基酸序列分析发现:NS5区存在B细胞和T细胞抗原决定簇表位.
2.RT-PCR检测HCVRNA的引物设计.从HCV的基因结构上可以看出，HCVRNA中各个区域碱基序列的保守程度不同，其保守程度由高到低依次为:5'UTR区>C区>NS3区>NS4区、NS5区>NS2区>NS1/E2、E1>3'UTR区.要对HCVRNA进行RT-PCR扩增其引物应选择在保守性高的区段，这样才能获得较高的检测率.因此，在进行RT-PCR检测时，引物大多选在保守性最高的5'-UTR区.西班牙的Castillo曾对各区的引物进行了比较，结果检测率分别为:5'-UTR为90%;C区为20%;NS3为80%;NS3/NS4为60%，NS560%.这一结果基本符合各区的碱基序列的保守程度的排列顺序，例外的是C区引物，它的检测率只有20%.原因在于C区虽然保守，但仍存在变异性较大的序列，而这个C区的反义链引物(用于反转录和PCR)正处在这种序列上，其中8/18个碱基在不同毒株间是不同的.由此提示我们选用5'-UTR区进行HCVRNA的RT-PCR扩增是最好的，另外还应注意的是引物不仅要设计在保守性高的区域，而且要处在保守的序列上.同时还应避开可能存在的茎环结构区.
三、病原体检测现状
由于HCV体积很小(直径约55-65mm)，在血液中的含量较低(平均约104COP./ml).另外，体外培养HCV目前尚未取得成功，因此直接进行HCV病原体的检测还没有一个成功的方法.目前进行HCV检测的方法主要是用免疫学方法和PCR法.
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