构建遗传图谱

　　三位点杂交。在DNA水平上能够对单个精子分型将会提供一条新的途径来决定DNA 多态性的物理顺序，而这些顺序的连接是如此地紧密（少于1％重组）以致于用家系分析的方法是无法确寂的。在随机多态性与致病基因座紧密连锁的情况下该方法特别有意义。由于该方法能够检测大量的减数分裂产物，即使紧密连锁的多态性也能够通过三点杂交来排序。这类精细的结构图谱可能在导致疾病的基因座的定位方面具有十分重要的价值。当然，由于精子并不具有疾病的表现型，不能直接用该方法对一个未知的疾病基因座多态性进行与DNA多态性相关的图谱定位。根据实验遗传学的经典方法能够用三点杂交法来推知染色体上的遗传标记的线型排列。假设一个男性是三因子杂合体，这3个因子在一个染色体上三个紧密连锁的基因座A，B，C上，其相对应的等位基因区段为a，b，c，且三个基因座的顺序未知。用单精子定型的方法可推知这些遗传标记的相位。这是因为对于紧密连锁的多态性，最常见的精子类型是非重组的。根据在八种可能的减数分裂产物中所能观察到的两种最少的类型，就能决定它的顺序。于是，如果ABC和abc为最常见的类型，那么这些类型为非重组的。如果为ABc，与此相对的等位基因abC、AbC和aBc的数量居第二，aBC和Abc最少见，那么后两种减数分裂产物可预期为双交换所致。如果基因座A位于B和C之间（BAC和CAB），与此相 关的频率就是所预期的结果，于是就可以确定基因的顺序。

　　Michael Boehnke（密执安大学）根据精子三点杂交的结果已设计出一个卓有成效的方法来决定基因的顺序。Boehnke的计算表明如果相邻遗传标记的间距低至0.5% 的重组，只需对少到600个配子的分析就能够精确地决定三个基因座的次序。我们要指出，即使同种标记的完全重组频率在男性和女性之间也有所不同，但该方法确定基因座的次序对“假象”对这种研究的分辩率无绝对影响，在扩增过程中三对引物同时存 在的条件下，扩增的效率也不会受到影响。最近已有报道使用大量的基因组DNA（与 单个精子相对）可同时扩增多至七个独立的片段。在单精子的扩增过程中同时用5对 引物，结果表明特异的靶DNA以高效率扩增，没有由于另外四个基因座的同时扩增而 受到影响。

　　多态性标记的选择。为了使多态性在用PCR对精子分型中有用，一定得知道位于 多态性位点两侧的序列。每一侧的已知序列不必超过20－30BP，这已为PCR引物的选 择提供了回旋的余地。不幸地是许多具有RFLP的cDNA和基因组克隆的本身无多态性位 点，因此需要进行额外的克隆和序列分析以使它有用于PCR分析。除了要知道用作引 物的序列，通常不对RFLP进行大范围的分析来揭示核苷酸的替代情况。在有些情况下，PCR产物可用限制性内切酶酶解直接分析RFLP，尽管在单个细胞的实验中我们常常看到经EB染色后出现的多条带干扰了研究对象。此外，大多数样品进行限制性酶解以及凝胶电泳（可能是Southern印迹杂交）将会比打点杂交要费力得多。

　　以连续重复序列或VNTR的不同数目为基础的RFLP，它的特殊形式在常规的基因图 谱的研究方面十分重要。如果能得到重复单位的基因族两侧的20－30BP的DNA序列， 经PCR、凝胶电泳、EB染色就有可能区别等位基因。在DNA基因组研究方面，最近已有 对经PCR扩增的VNTR进行分析的报道。如果有可能消除单个细胞扩增实验出现的多条 带，VNTR多态性就能够用于精子分型的研究。

　　是将已知RFLP转变成可用PCR分型的标记更为有效还是设计快速检测多态性的技术更容易适合于PCR分析目前仍不清楚。当然，有许多新方法与PCR结合用来检测多态 性。Leonard Lerman的变性梯度凝胶电泳法（DGGE）可成功地检测出单个碱基的突变，该方法使用GC发夹或者用经多个限制性酶解的改进DGGE可分析PCR产物。PCR产物中的核苷酸置换也可以用RNaseA错配分析法来分析。一旦用上述方法检测出了多态性时，它的位置以及该闰点附近的序列就不难确定了，这样也为ASO探针的合成提供了必要的数据。运用这些新方法，可从已经过Southrn杂交和图谱分析检测的RFLP克隆 中发现新的多态性。这可能在加速将RFLP转变为PCR分析以及对与致基因座紧密连锁 的RFLP进行定位等方面具有重要的意义。