近年来细胞凋亡现象不仅为生物学研究者，同样也受到了临床医生的重视。肝细胞的凋亡与多种肝病有关，据目前所知在以下肝病中肝细胞凋亡现象增加：病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、原发性毛细胆管性肝硬化、Wilson病、缺血后再灌注的肝损伤等；而在肝细胞肝癌和胆管性肝癌时肝细胞凋亡现象减少［1］。
有关病毒性肝炎的细胞凋亡现象知之最早，Kerr等［2］在1972年就提出了细胞凋亡(apoptosis)的名称，7年以后Kerr等［3］又明确指出，慢性活动性肝炎时门脉周围所见的所谓碎屑样坏死(piecemeal necrosis)主要是肝细胞凋亡，但肝细胞凋亡残骸被周围细胞（包括周围肝细胞及吞噬细胞）迅速清除，而仅留的坏死及炎性改变却被认为是肝炎的特征之一，Kerr的报告被忽视达20余年之久。近年由于对人体细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的研究和对线虫细胞凋亡的研究进展，肝病时的细胞凋亡再次受到人们的注意。众所周知，病毒性肝炎时，肝内常同时出现肝细胞坏死和肝细胞凋亡两种现象：即通过CTL产生的穿孔素(perforin)和颗粒酶B(granzyme B)所引起的以肝细胞膜破损为特征的坏死，及以CTL表达的Fas配体(FasL)和肝细胞表达的Fas结合所引起以DNA断裂为特征的凋亡。二者都和CTL有直接关系，二者的出现互有联系，但肝细胞受感染后表现为坏死或凋亡，其转换关键是什么却一直不大了解，近年在细胞水平的实验中初步证明，出现坏死或凋亡取决于细胞能量的供应如何。Leist等［4］证明，肝细胞坏死过程中不论从糖酵解或从线粒体得到充分的ATP供应时，可以转为凋亡，而对正在凋亡的细胞断绝ATP补充时就转换为坏死［5］。虽然这是体外细胞水平的实验，体内如何尚待研究，特别是什么机制使不同细胞的能量供应发生差异还远未明了，但这一发现十分值得重视，因为它初步提示外部因素可能影响坏死和凋亡的进程，远期可能具有实用价值。
肝细胞凋亡在开始时必须有肝细胞表达的死亡基因受体(death domain receptor)和淋巴细胞表达的相应配体结合才能开始。这包括(1)FasL及其受体Fas；(2)转化生长因子β(TGFβ)及其受体TGFβ R；(3)肿瘤坏死因子(TNF)及其受体TNF R；(4)TRAIL(TNF related apoptosis inducing ligand)和其受体CD4及CD5等，以下仅就目前研究较多的FasL和Fas作一初步介绍。
一、近两年对细胞凋亡的研究
近两年的实验研究显示，细胞凋亡发生机制涉及面很广，虽然这些研究仍未能对肝炎出现的细胞凋亡现象加以说明，但对今后理解会有所帮助。近年的实验研究概括起来有一点，即由Fas和FasL所导致的细胞凋亡是一系列胱氨酸酰门冬氨酸特异性蛋白酶(caspase酶)的激活所引起的，但是最初激活caspase的因子是什么，以后一系列caspase是如何层层激活的，最后caspase作用于细胞内什么靶蛋白，这种靶蛋白的裂解物最终怎样导致凋亡，这都是目前正在积极研究的问题［6］。
二、什么是caspase
人们在研究线虫(nematode)的细胞凋亡现象时得知，导致线虫细胞凋亡的过程中至少有14种基因起作用，这些基因被统称为细胞死亡基因，略作ced基因。ced基因中了解较多的有ced-3和ced-4，二者都是促凋亡基因(pro-apoptotic)，还有ced-9是抗凋亡基因(anti-apoptotic)。这些基因经cDNA克隆后，经过在人体内大力寻找发现了和线虫相类似的基因，当时暂被命名为CED-3和CED-9，而此CED-9即近似已熟知的人体中抑制细胞凋亡的Bcl-2,CED-3近似白细胞介素-1β转换酶，此酶原命名为ICE，现被命名为caspase-1。过去并不知人的ICE和细胞凋亡有关，由于当线虫的ced-3发生变异时可使发育中线虫的131种细胞凋亡现象消失，提示ced-3对凋亡至关重要。经过在人体细胞的研究发现，ICE(即caspase-1)可能是参与人体中细胞凋亡的酶，而以后的研究证实了这一推断。一系列caspase酶后面的序号并不提示它在凋亡中发挥作用的先后，只提示人们对它分离成功及序列分析的先后，但caspase(cysteinylasp artate specific proteinase)这一词能指出这一族蛋白裂解酶的特定意义，即它是胱氨酸蛋白裂解酶，且它的特定裂解部位是在门冬氨酸之后。目前已经证实，人体中caspase至少有13种。caspase这一族蛋白裂解酶从功能上大概有两方面，caspase-2、-3、-8、-10主要起凋亡作用,而caspase-1、-4、-5偏重于起炎症反应作用。caspase在未被激活前都称为procaspase,在胞浆内procaspase-8(此外可能还有procaspase-2、-10)位于接近细胞膜处,由于Fas是穿膜蛋白(type 1 integral membrane protein)，故考虑凋亡开始时最早和Fas接触的是procaspase-8,以后体外试验也证明caspase-8可以裂解caspase-3、-4、-7、-9,而caspase-10也可以裂解caspase-3、-7、-8,故目前认为参与凋亡最早的caspase是caspase-8,至于体内生理情况下是否有其他caspase参与启动尚待进一步确定［7］。
对凋亡研究的现状有两点应加以说明，首先，caspase是由于对线虫凋亡的研究而在人体中发现的。目前已知ced至少有14种，人体的caspase已确定13种，还在继续寻找。但至今还不能确切指出哪一种ced相当于哪一种caspase，所以说某一ced和某一caspase“同源”是不恰当的。例如，从caspase-1到caspase-10的10种caspases都和ced-3有一定的相同序列，但这种相同序列仅占25%～35%，因之两者不能勉强一一对应。其次，为什么凋亡要有如此多的ced,人体凋亡要有如此多的caspase现在也还不清楚。如果说caspase也像凝血因子一样是“瀑布式”(cascade)的层层激活，现有资料还不能证明。是否为不同组织、不同基质需要不同caspase或细胞内不同部分(如核、胞浆、线粒体)需要不同caspase参加。更为复杂的是，凋亡细胞中存在caspase裂解为大小不同的片断，这些片断是否有不同作用都待今后的研究。
三、什么因子开始激活procaspase
当人的细胞开始凋亡时，可见到细胞色素C从线粒体迅速释放于胞浆内，在胞浆中激活一系列蛋白裂解酶，这个现象为研究凋亡开始提供了重要线索。
前面已经提到caspase可以裂解一系列基质(包括caspase族本身)最后导致凋亡，但caspase本身是如何被启动激活的呢?这也需要借助于线虫凋亡的实验结果。线虫细胞凋亡的开始途径已比较明确，是由线虫的pro-ced-3和ced-4相互“作用”而引起的，如果ced-4发生变异就不可能出现凋亡，提示ced-4是惟一可以激活ced-3的物质。但在正常无凋亡的细胞中ced-4是与ced-9结合的，这种结合的结构使ced-4处于不活化状态，不能激活ced-3，故不能发生凋亡。所以线虫细胞凋亡的启动顺序可以简单地归结为ced-9、ced-4、ced-3［8］。Wang等的实验证明，人体细胞凋亡的启动和线虫类似，并成功地从人的细胞提取物中分离出3种蛋白，命名为“凋亡蛋白酶激活因子”(apoptotic protease activating factors，APAFs)也称为“凋亡启动因子”(apoptosis initiating factors，AIFs)，最近证明这3种APAFs中的APAFs-1即相当于线虫的ced-4,APAFs-3相当于ced-3，而长久不明的APAFs-2是位于线粒体的内膜外面的细胞色素C，这样就可以理解凋亡启动时大量细胞色素C释放于胞浆的原因了。这样人体细胞凋亡的激活开始顺序成为APAFs-2、APAFs-1、APAFs-3与在线虫中所见顺序ced-9、ced-4、ced-3十分相似［9］。
细胞色素C（即APAFs-2）为什么会在凋亡出现前迅速从线粒体内膜释放于胞浆激活APAFs-3，从而引起以后一系列裂解呢?Polyak等的实验提示，线粒体迅速释放细胞色素C(甚至还有其他未明的启动因子AIFs)是受核内p53所诱导的新基因(p53 induced gene，PIG-3)所促成的，这还仍在进一步研究中［10］。
对凋亡的启动原因，目前认为虽然线粒体更为直接明显，但实际上核内p53所诱导的新基因、膜上的Fas-FasL和线粒体内膜三者都是必不可缺的［11］。
四、caspase怎样向下传达凋亡信号
如上所述，当Fas和FasL结合时最早和膜下Fas部分接触的为procaspase-8。从结构上看，procaspase-8的N端是具有两个60aa(氨基酸残基)，是极易和其他蛋白连接的部分，这部分具有蛋白和蛋白连接功能的序列，被称为死亡效应区(death effector domain，DED)，然而此时procaspase-8还必需另一种称为“适应”蛋白(adapter)的参与才可被激活。此“适应”蛋白名为“Fas伴随性死亡基因区蛋白”(Fas associated death domain protein，FADD)，值得注意的是，Nagata于1993年发现的Fas中曾包括了FADD序列中的80aa，以后Goeddel等称此区为死亡基因区(death domain，DD)。前述procaspase-8的蛋白与蛋白的连接部位即指procaspase-8的DED、FADD和DD的连接部位，既往认为Fas具有死亡基因区实际上是FADD的DD及procaspase-8的DED二者的连接部位，正如Dixit指出，所谓死亡基因区不是别的，只不过是蛋白和蛋白的相互作用区而已，死亡的原因还待继续寻找。caspase-8和FADD作用后如何形成所谓死亡诱导信号复合物(death-inducing signaling complex)，此复合物又如何层层作用于其他一系列caspase,是瀑布式的或其他方式的激活，以及最终细胞内的靶蛋白是什么，仍然尚不明确。
五、caspase的最终靶蛋白是什么
细胞内被称为最终靶蛋白究竟指什么一直没有定论，最近Nagata等证明，细胞内所谓最终靶蛋白实际上就是生物分子结构最复杂的染色质(chromatin)，而作用于染色质的蛋白裂解酶是caspase-3，并证明caspase-3不能直接作用于染色质而是先作用于另一具有343aa的碱性核酶，由于此核酶能被caspase-3所“活化”，故名为“caspase活化性核酶”(caspase-activated DNase，CAD)。此酶能在DNA上识别一定的序列并在该处使其断裂而成“梯形染色质”(chromatin ladder)，一般认为这是细胞凋亡的典型表现［12］。Nagata等还报道，在未发生凋亡的细胞内只能检出CAD的抑制物(ICAD)而检不出CAD，这是由于ICAD平时和CAD结合并抑制着CAD的作用，当ICAD被caspase-3裂解时即释出CAD，说明ICAD具有被caspase裂解的部位，而CAD无此部位，ICAD为一种酸性蛋白，以两种形式存在，性质相同，分别为265aa及331aa。以上所述似乎初步可以说明细胞凋亡时“梯形染色质”出现的原因了，但人们不禁要问和凋亡细胞相邻的、生长中的正常细胞同样有染色质，同样有ICAD和caspase-3，为什么不发生凋亡呢?不仅不发生凋亡反而主动地把邻近凋亡细胞的遗迹（凋亡小体）很快不留痕迹地处理掉呢?这显然提示细胞凋亡不是单个细胞垂直一线的裂解过程，而是和周围有尚未明了的横向网络联系，例如各种细胞因子等，然而目前对此知之甚少。我们目前了解到，使染色质断裂的是CAD而非caspase-3，这是对凋亡的认识深入了一步，然而染色质梯形断裂是凋亡的最终结果，还仅是凋亡正在进行的过程，尚待对ICAD/CAD途径的进一步研究［13，14］。
六、促进或抑制凋亡的因素
前述的p53、导致细胞坏死的颗粒酶B(granzyme B)和穿孔素都兼有凋亡促进作用。人体本身就有一系列抑制凋亡的基因蛋白(IAP)，例如Pitti等发现，人体除Fas可以和FasL结合外，还有类似Fas的分子，称为伪装受体(DcR3)，它也和FasL结合而不传达凋亡信息，平时对凋亡可以起调节作用，但肿瘤可以大量产生DcR3使肿瘤不能凋亡。牛痘病毒的CrmA(cytokine response modifier-A)可以抑制caspase-1、-8、-3、-6，而杆状病毒(baculovirus)产生的p35蛋白可抑制caspase-1、-2、-3、-4。它们的生物学意义还不清楚，可能病毒防止细胞凋亡有利于病毒的传播，这些都有待今后研究，至于病毒性肝炎有无CrmA类似物尚未见报道。
以上简要介绍了细胞凋亡研究进展的近况，而且是只限于Fas和FasL,可以看出我们尚远未能判明凋亡的发生机制及过程，对凋亡和坏死的分歧点何在也知之甚少。深入研究凋亡可能对疾病的发病机制会有更深的理解，而研究caspases的启动、信号传达以及CAD等都是刻不容缓的课题。
作者单位：100700 北京军区总医院、解放军肝病研究所
参考文献
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11 Wyllie A. Apoptosis. Clues in the p53 murder mystery. Nature, 1997,389：237-238.
12 Enari M, Sakahira H, Yokoyama H, et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apopotosis, and its inhibitor ICAD. Nature, 1998,391：43-50.
13 Sakahira H, Enari M, Nagata S. Cleavge of CAD inhibitor in CAD activation and DNA degradation during apoptosis. Nature, 1998,391：96-99.
14 Wyllie A. An endonuclease at last. Nature, 1998,391：20-21
细胞凋亡的研究方法
一、 定性和定量研究
只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜）
进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA定量琼脂糖凝胶电泳。
二、区分凋亡和坏死
可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法），Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测，AnnexinV/PI双染色法流式细胞仪检测等。
不能将二者区分开的方法：原位末端标记法、PI单染色法流式细胞仪检测等
三、样品来源不同选择
组织：主要用形态学方法(HE染色，透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记，ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳)。
四、细胞凋亡检测
1、 早期检测:
1) PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测
2)细胞内氧化还原状态改变的检测
3)细胞色素C的定位检测
4) 线粒体膜电位变化的检测
2、 晚期检测：
细胞凋亡晚期中，核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。
对于晚期检测通常有以下方法：
1) TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记)
2) LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测)
3) Telemerase Detection (端粒酶检测)
3、生化检测：
1）典型的生化特征：DNA 片段化
2）检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等
3）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记）
4）通过DNA末端转移酶将带标记的 dNTP （多为dUTP）间接或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。
4、LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测)
当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。通过LM-PCR,连上特异性接头，专一性地扩增梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。 5ibio.com 版权所有
上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。需结合其它的方法来检测细胞凋亡。
其它方法：
1）Telemerase Detection (端粒酶检测)
端粒酶是由RNA和蛋白组成，它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列，使细胞获得“永生化”。正常体细胞是没有端粒酶活性的，每分裂一次，染色体的端粒会缩短，这可能作为有丝分裂的一种时钟，表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现，90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。
2）mRNA水平的检测
研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。据报道，Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞（cytotoxic T cells）等靶细胞。Bcl-2 和bcl-X (长的) 作为抗凋亡（bcl-2 和bcl-X）的调节物，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。用荧光定量PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确。通过检测fas, bax-alpha 和 bcl-X (长的) 基因的 mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测。
5、细胞内氧化还原状态改变的检测：
正常状态下,谷光苷肽(GSH)作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。这一反应在线粒体中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。当细胞内GSH的排除非常活跃时，细胞液就由还原环境转为氧化环境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。
6、细胞色素C的定位检测
细胞色素C作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞浆，结合Apaf-1 （apoptotic protease activating factor-1）后启动caspase级联反应：细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。
7、线粒体膜电位变化的检测：
1）线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系
2）近年来陆续有报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面。而一旦线粒体跨膜电位耗散，细胞就会进入不可逆的凋亡过程。
3）在细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性转变，这是由于生成了动态的由多个蛋白质组成的位于线粒体内膜与外膜接触位点的通透性转变孔道(PT孔道)能稳定线粒体跨膜电位就能防止细胞凋亡。
线粒体在细胞凋亡作用中的进一步证据：
1）若将纯化的正常的线粒体与纯化的细胞核在一起保温，并不导致细胞核的变化。但若将诱导生成PT孔道的线粒体与纯化的细胞核一同保温，细胞核即开始凋亡变化。
2）形态学观察，看到细胞数目有限，统计学上的准确性受影响；
3）凝胶电泳检测DNA破坏了细胞的完整性也不能测出凋亡细胞占总细胞的比例； www.5ibio.com
4）流式细胞术可检测细胞、亚细胞及分子水平的特征性变化。
用于流式细胞仪检测的染料：
PI、Hoechst、 EB、 DAPI、丫啶橙等，其中PI、Hoechst最常用。
PI和Hoechst33342双标：
PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但是PI不能通过正常的细胞膜，Hoechst则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。
故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。
PI和Annexin-V双标：
磷脂酰丝氨酸（PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期（或细胞损伤时）PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
Annexin-V（green）可以和磷脂酰丝氨酸（PS）特异性结合。因此细胞处于调亡或坏死时，Annexin-V可为阳性（早期的坏死细胞可能为阴性）。但是只有坏死的细胞PI是阳性 5ibio.com
五、形态学观察
1、普通光学显微镜观察
2、透射电子显微镜观察
3、荧光显微镜观察
1、普通光镜下观察：
1)用苏木素-伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞），正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失
2)Giemsa染色法、瑞氏染色法等，正常细胞核的色泽均一，凋亡细胞染色变深，坏死细胞染色浅或没染上颜色
直接用倒置显微镜观察：
1）细胞体积变小，全面皱缩；
2）凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。
2、透射电子显微镜观察
凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。
细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样，部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
3、荧光显微镜
常用的荧光染料：丫啶橙、 PI 、DAPI、Hoechst33258 和Hoechst33342、EB等
Hoechst 33342、Hoechst 33258、 DAPI三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。
1）PI双染色法基本原理
Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。
DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。
碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
注意事项：细胞凋亡时，其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。 5ibio.com 版权所有
六、细胞凋亡的分子生物学检测方法:
细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²+和Mg²+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。低分子量的DNA分离后，也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。 做最大最全的生物试验方法网站
过氧化物酶标记测定法
原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察。
毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体，因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1％，若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后，则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用。
本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定。
(一)试剂配制
1、磷酸缓冲液PBS（pH7.4）：磷酸钠盐 50mM，NaCl 200mM。
2、蛋白酶K（200μg/ml，pH7.4）：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml。
3、含2%H2O2的PBS缓冲液（pH7.4）：H2O2 2.0ml；PBS缓冲液 98.0ml。
4、TdT酶缓冲液（新鲜配）：Trlzma碱 3.63g用 0.1N HCl调节pH至 7.2，加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸钠 29．96g和氯化钴0.238g。 5ibio 我爱生物
5、TdT酶反应液：TdT酶32μl；TdT酶缓冲液 76μl，混匀，置于冰上备用。
6、洗涤与终止反应缓冲液：氯化钠 17. 4g；柠檬酸钠 8.82g；ddH2O 1000ml
7、0.05％二氨基联苯（DAB）溶液：DAB 5mg；PBS 10ml，pH7.4, 临用前过滤后，加过氧化氢至0.02%。
8、0.5％甲基绿（pH4.0）：甲基绿0.5g；0.1M乙酸钠100ml。
9、100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。
10、 过氧化物酶标记的抗地高辛抗体（ONCOR）
（二）实验步骤
1、标本预处理：
（1）石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次5min。用无水乙醇洗两次，每次3min。用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug／ml），于室温水解15min，去除组织蛋白。用蒸馏水洗4次，每次2min，然后按下述步骤2进行操作。
（2）冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10％中性甲醛中，于室温固定10min后，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃处理5min，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。
（3）培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约 5 × 107个/ml细胞于 4％中性甲醛室温中固定 10min。在载玻片上滴加 50～100μl细胞悬液并使之干燥。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。
2、色缸中加入含2％过氧化氢的PBS，于室温反应5min。用PBS洗两次，每次5min。
3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加2滴 TdT酶缓冲液，置室温1～5min。
4、 用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反应液，置湿盒中于37C反应 1hr（注意：阴性染色对照，加不含TdT酶的反应液）。
5、将切片置于染色缸中，加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液，于37℃保温30min，每10min将载玻片轻轻提起和放下一次，使液体轻微搅动。
6、 组织切片用PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30min。
7、用PBS洗4次，每次5min。
8、在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05％DAB溶液，室温显色3～6min。
9、用蒸馏水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。
10、 于室温用甲基绿进行复染10min。用蒸馏水洗3次，前两次将载玻片提起放下10次，最后1次静置30s。依同样方法再用100％正丁醇洗三次。
11、 用二甲苯脱水3次，每次2min，封片、干燥后，在光学显微镜下观察并记录实验结果。
（三）注意事项
一定要设立阳性和阴性细胞对照。阳性对照的切片可使用DNaseI部分降解的标本，阳性细胞对照可使用地塞米松（1μM）处理3-4hr的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞。阴性对照不加TdT酶，其余步骤与实验组相同。
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