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RNA干涉
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发布时间：2007-02-04
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曹国军 邵宁生
军事医学科学院基础医学研究所
摘要：
本文首先简要综述了RNAi的发现，发展和越来越广泛的应用。随后介绍了目前公认的RNAi的作用机制，双链RNA被Dicer剪切成siRNA，在体内组装成蛋白复合体，在siRNA的引导下切割靶RNA，或者以靶RNA为模板合成新的双链RNA，进一步被Dicer识别和剪切。还列举了RNAi的可能应用领域，包括基础和应用研究方面，并简单介绍了RNAi的应用方案。最后分析RNAi机制中未能清楚的方面和应用中的困难。
关键词：RNAi，siRNA，gene silencing，RISC
基因沉默（gene silencing）是生物体内特定基因由于种种原因不表达的遗传现象。一方面，基因沉默是生物遗传操作创造新的遗传修饰生物（genetically modified organisms）的障碍，另一方面，它又是植物抵抗外来核酸入侵（如病毒）的一种反应。近年来，在不同的研究领域和生物中发现了许多新的使基因沉默的类型，并赋予其不同的名称：在植物中称为RNA 共抑制(co-suppression)，在真菌中叫RNA 压制(quelling)，动物中则叫RNA干涉(interference)。RNA干涉是指短的dsRNA 可以降解内源的同源RNA,，而使相应基因沉默的现象，简称RNAi。
现在，RNAi技术在机制和应用方面均有了惊人的进步，RNAi或相关的siRNA（small interference RNA）在2000－2003年，连续4年列入十大科技进步之一。无论在基础研究领域，例如功能基因组研究，还是在医学应用领域，RNAi都是一种不可多得的有力工具。
一、RNAi的发展
1995年，康乃尔大学的Su Guo在利用反义RNA技术特异性地抑制秀丽新小杆线虫（C. elegans）中的par-1基因的表达时，意外发现对照实验中给线虫注射正义RNA（sense RNA）也能抑制par-1基因的表达。该研究小组一直未能给出合理解释。直到1998年2月， Andrew Fire和Craig Mello才首次揭开这个悬疑：Su Guo遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起，当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。该小组将这一现象称为RNA干涉（RNA interference ,简称RNAi）。
在随后的短短一年中，RNAi现象被广泛地发现存在于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。随后在线虫中的研究发现RNAi过程中的第一步是序列特异的效应分子(siRNA)的产生，此效应分子存在的第一个证据可能是在植物PTGS（post-transciption gene silence转录后基因沉默）过程中发现的21~25nt的RNA分子。用果蝇胚胎提取物进行体外RNAi反应，其中的dsRNA（double-strand RNA 双链RNA）被切割成~22nt的siRNA，导入化学合成的21-和22-nt的siRNA也同样促进同源mRNA的降解。之后在注射dsRNA的果蝇胚胎和线虫中，以及转染了dsRNA的果蝇S2细胞中均发现了小RNA产物。2001年，Emily等人在果蝇中确定了降解dsRNA的关键酶，并命名为Dicer，此酶属于RNaseIII家族，并在进化上保守。之后，Wianny等在小鼠胚胎中，Svoboda等在小鼠的卵母细胞中完成RNAi的实验，Elbashir等在哺乳动物细胞中用siRNA诱导产生了特异性的RNAi，RNAi技术迅速扩展到哺乳动物领域。
至此RNAi技术作为基因沉默的有力工具，在医药开发、基因治疗和功能基因组研究等方面的应用得到飞速发展。
二、RNAi的机制
目前，我们对RNAi机制的理解主要是来自线虫与植物的遗传学分析和果蝇提取物的生化研究。尤其是后者，Carther和Sharp等人建立的体外RNAi模型为阐明RNAi的机制提供了便利的工具。随着研究的不断深入，关于RNAi的作用机制和途径的描述越来越清晰。
通过对果蝇胚胎提取物和S2细胞的生化分析提出的RNAi作用机制模型认为：RNAi过程有四个步骤。RNAi的起始是dsRNA被剪切成siRNA，此步骤需要ATP提供能量；随后这些siRNA被组装成无活性的蛋白复合体；消耗ATP的能量，siRNA解链将无活性的复合体转变成活性形式；最后，在无需或少量ATP的帮助下，该复合体以siRNA为指导，识别并切割互补的靶RNA。
第一步中siRNA产生的关键酶是Dicer，在线虫中的同源蛋白是DCR-1，拟南芥则是CARPEL FACTORY（CAF/SIN-1），它们都属于双链RNA特异内切酶RNaseIII家族。siRNA特征是21~25nt的短双链，5`磷酸化（这是必要的），3`为羟基末端且有两个不配对核苷酸，此结构形式可能对siRNA进入蛋白复合体是必须的。不同的siRNA长度可能反应了物种之间Dicer同源蛋白的空间和结构的不同。
siRNA组装的蛋白复合体被命名为RISC（RNA-induced silencing complex），尽管现在还未能建立体内靶RNA特异降解的机制，但生化研究的观点认为，每个RISC仅含有一个siRNA和一个剪切核酸的蛋白。RISC复合体大约为500kD，其组成成份目前还没有完全搞清楚，仅知的是其中含有Argonaute蛋白家族成员等，例如线虫中的QDE-1，果蝇的Ago-2，人的eIF2C等均是相应的RISC组成成份，该蛋白家族均含有PAZ domain和PIWI domain。活性形式的RISC仅含有siRNA的一条链，故RISC复合物中可能还存在一个RNA螺旋酶。统计学及实验均表明，siRNA的两条链对形成活性RISC复合物是非对称的，其中一条易于进入复合体中，而另一条链则较难，其可能机制是siRNA链序列的热力学性质决定的。活性RISC复合物对靶RNA的切割作用发生在与siRNA互补序列的中间部位。
然而在线虫和植物中的遗传学分析表明，RdRP（RNA-dependent RNA polymerase, RNA依赖的RNA聚合酶）对RNAi是必须的，因此又提出了一个随机降解的PCR（random degradative PCR）模式，也即RdRP以配对的siRNA为引物，以靶RNA为模板，类似PCR扩增形成dsRNA，然后由Dicer切割形成新的siRNA，进入下一步的反应。此模型可能解释了RNAi的高效性，因为RdRP扩增了siRNA的数量，于此相对应的是在哺乳动物和果蝇中的高效性是因为活性RISC是一种“酶”，可以催化多轮剪切反应。另外一个可能的证据是线虫、植物和果蝇胚胎提取物中RNAi的transitive现象：引入一段siRNA，其切割作用可以远离靶RNA上的互补序列，基因沉默信号可以沿着基因移动。在线虫中还发现了RNAi的spreading现象，RNAi可以从一个组织扩散到全身，其中的关键蛋白为SID-1[9, 10]。因为到目前为止在人和果蝇成虫中均未能发现RdRP或其同源蛋白，以及transitive和spreading现象，故认为人和果蝇的RNAi并没有采取这种模式，而仅有RISC的核酸酶活性。[2]
在真菌和植物中还发现了RNAi抑制基因的一种新的可能机制：诱导基因组的甲基化。当甲基化发生在启动子区时，可以抑制基因的转录。[3]
2000年，在线虫和人细胞内也发现了~21nt大小的RNA，其特点是由茎环样的单链前体剪切而来，其中的关键蛋白也是Dicer，并且也形成蛋白复合体miRNP。这类RNA命名为microRNA（miRNA），至今在动植物体内已鉴定出500多个。现在公认的miRNA的功能也是转录后基因沉默，它们在生物体的发育，生长分化，凋亡等方面可能都起着关键的作用。它与siRNA的区别，一是内源性的；二是在功能机制上，miRNA与靶RNA不完全互补，因此不能介导靶RNA的降解，但能阻抑蛋白的翻译。尽管miRNA与siRNA有着很多的不同，但是它们形成中都需要Dicer，形成的复合体中也均有Argonaute蛋白家族成员，人工的siRNA在体内也能产生类似miRNA的功能，而内源的miRNA也能剪切完全互补的靶RNA，推测它们可能具有基本相同的途径。[6]
三、RNAi的应用
为什么自然界动植物中存在RNAi现象？它的生物学意义是什么？这些问题尚未能彻底回答。目前普遍认为生物中自然存在RNAi的作用是在动植物中作为基因组免役系统（Genome immune system）有效防止外源有害基因如病毒的侵入，另外是基因表达调控的一个重要途径[7]。天然存在的RNAi现象不但具有十分重要的生物学意义，RNAi技术在生命科学研究中也具有及其广泛的应用前景。
（一）RNAi可能的应用领域
1、功能基因组的研究[5]
在功能基因组研究中，需要对特定基因进行功能丧失或降低突变，以确定其功能。由于RNAi具有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低的突变，因此RNAi可以作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。RNAi技术高效、特异、低毒性、周期短、操作简单等优势是传统的基因敲除技术和反义技术所无法比拟的。根据基因组测序结果或EST文库构建的dsRNA文库可以用于大规模的基因组筛选。根据DNA芯片原理，将微电子技术与RNAi技术结合，构建RNAi芯片，让细胞生长在多种siRNA片段组成的点阵芯片上，只要解决好核酸从固相化物的解离问题（如利用核酸酶切割）和转染技术问题，就能产生各种基因功能失活表型库，并得到相应的mRNA-表型对应关系。联合应用DNA芯片技术还可能得到各个基因间相互影响的网络关系。甚至可以应用RNAi建立基因功能敲除动物模型代替繁琐的传统基因敲除。
2、 在其他基础研究领域
例如在信号传递途径中，根据RNAi产生的功能丧失表型，可以很容易的从某一信号传递途径被打断的所有表型中鉴定出被降解的mRNA，从而鉴定出参与了信号传递通路的信号分子。还有可能通过打靶某一信号分子mRNA明辨其与其它信号分子在传递通路中的关系。
在发育研究中，已经发现许多miRNA可能参与其中的基因调节，例如在线虫中，let-7和lin-4对幼虫发育起着关键作用；而在拟南芥中，miR-172参与花发育的调节。这提示RNAi现象可能对发育也是极其重要的。
3、疾病治疗
一方面，RNAi可以直接用于疾病相关基因的抑制，从而达到疾病治疗或预防的目的。例如在抗肿瘤治疗中，RNAi可用于抑制癌基因的表达；或者利用RNAi 的高度特异性敲除点突变激活的癌基因；也可用于抑制基因扩增或抑制融合基因表达；还可用于抑制其他与肿瘤发生发展相关基因（如血管内皮生长因子VEGF或多药耐药基因MDR）的表达。在治疗病毒性疾病的研究中，可以设计针对病毒基因组RNA的siRNA或针对宿主细胞病毒受体的siRNA来抗病毒，目前针对乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、流感病毒（influenza virus）、脊髓灰质炎病毒（poliovirus）、HIV-1、SARS等均取得了令人欣喜的体外病毒抑制作用。但是由于目前基因治疗普遍存在的缺少高效低毒的转运载体，限制了RNAi在体内的应用。另一方面，目前更可能实现的是利用RNAi确定新的疾病相关基因，尤其是建立高通量的RNAi功能分析方法可以为下一步的药物筛选提供更多的可能靶蛋白；并可以利用RNAi来确认许多疾病的发生发展机制，为其治疗提供依据。[4,8]
4、 在植物中的应用
RNAi的功能之一是保护基因组不被可移动的基因元件如转座子或病毒RNA的侵犯， RNAi效应在植物及线虫中还具有transitive和spreading现象，因而为植物中利用siRNA抗病毒提供了广阔的前景。根据RNAi的随机降解的PCR模式机制下，21nt大小的片段足可以在RdRp作用下产生对靶mRNA其它序列沉默表达作用。这种以靶mRNA为模板的PCR模式尤其适用于抗变异病毒：只需要根据病毒保守的序列设计siRNA，就可抑制所有的变异病毒。[5, 9]
（二）用siRNA沉默基因
RNAi在基础研究领域和医学研究领域的应用，其基础是siRNA的基因沉默作用。目前在体内或体外RNAi中应用的siRNA主要有两类：RNA和DNA载体。
1、 RNA
（1）siRNA：化学合成或体外转录的方法得到~21nt的两段小RNA，经退火后形成~19个碱基互补，两边3? 端各有2个碱基突出的siRNA。目前此类siRNA应用最广泛。尤其是经过修饰后提高稳定性的siRNA仍可表现特异的基因沉默作用，为其在体内的应用提供了可能的前景。
（2）esiRNA：因为上述的siRNA基因抑制的有效性关键在于靶基因序列片段的选择，但现在并不知道mRNA的哪一个部位对siRNA更敏感，所以根据靶基因mRNA设计的长dsRNA经Dicer剪切成一系列~21nt的siRNA－统称为esiRNA，可能更有效、更方便的抑制基因的表达。
（3）发夹RNA：根据miRNA设计的发夹RNA，或基于siRNA的发夹RNA在体内都表现出有效地基因抑制作用。
2、DNA载体
由于在哺乳动物和果蝇中不存在RNAi的扩增机制，导入以上RNA产生的RNAi作用不可避免的具有瞬时性。为了克服这个弱点，一些研究小组发展了基于DNA载体在体内表达siRNA的技术。这种载体可以是质粒，也可以是病毒，甚至可以是DNA片段。
（1）基于RNA聚合酶II启动子的表达系统：在弱或无干扰素应答反应的组织或细胞中，可以构建长的发夹RNA，进一步由Dicer剪切成siRNA。这种表达系统的优点是允许组织或细胞特异性的dsRNA表达，但是绝大部分哺乳动物细胞对长的发夹RNA的干扰素应答而产生非特异作用，限制了此类表达系统的广泛应用。
（2）基于RNA聚合酶III启动子的表达系统：目前主要应用的是U6启动子和H1启动子，一方面它们在体内有较高的转录效率，另一方面以数个连续T为终止信号，限制了RNA的大小从而不引起干扰素的非特异作用。此种表达系统还可分成三类：一是基于发夹RNA的基因沉默效应而设计的表达发夹RNA的质粒载体；二是在载体上构建两个启动子分别表达siRNA的正义RNA和反义RNA；三是共同导入分别表达siRNA的互补片段的含有U6或H1启动子的DNA片段，或者表达发夹RNA的DNA片段。尤其是后者，可以用PCR方法方便的获得，大大扩展了其应用。[1]
四、RNAi的问题与前景
尽管RNAi技术飞速发展，但在机制研究和应用方面还存在着许多问题。
在机制方面，至今仍不完全清楚的有：RISC的组成成份，它是否与miRNP是一致的，或者是部分一致的；RISC的组装步骤，其相关蛋白是如何与siRNA组合在一起的，如何成为活性形式等；以及对靶RNA的剪切作用，其相关的分子机制如何，是需要特异的蛋白来剪切靶RNA，还是引导的siRNA本身即有剪切作用等。在许多真核生物中都发现了RNAi现象，而在原核生物中却未发现，提示了RNAi的进化地位，但是其在进化中是如何出现的，如何保存下来的，在生物体中的意义有多大，目前均没有分析清楚，还需要更多的研究来阐明。
在基础研究应用方面，因为不完全互补的siRNA也可能抑制基因的表达，虽然其机制和相关的RNA序列要求仍未知，但有可能对RNAi的特异性提出挑战，RNAi不能完全区别出仅有几个碱基的突变。而靶RNA上与siRNA结合的部位特征还须进一步的确认，以提高siRNA设计的效率。
在应用研究领域，最主要的问题还是转运系统的选择，如何找到一种高效而低毒的用于人体的转运载体是摆在所有RNAi应用面前的最大敌人。
总之，随着RNAi研究的进一步深入，对RNAi机制的进一步理解，以及解决应用方面的限制因素，RNAi将是基因功能研究和疾病基因治疗的革命性工具。
主要参考文献
1、 Derek M. Dykxhoorn, Carl D. Novina and Phillip A. Sharp: Killing The Messenger: Short RNAs That silencing Gene Expression. Nature Reviews molecular cell biology 2003, 4: 457-467.
2、 Gy?rgy Hutvágner and Philip D Zamore: RNAi: nature abhors a double-strand.Current Opinion in genetics & Development 2002 ,12: 225-232.
3、 Gregory J.Hannon: RNA interference. Nature 2002, 418: 244-251.
4、 Mario Stevenson: Dissecting HIV-1 Through RNA Interference. Nature Reviews Immunology 2003, 3: 851-858.
5、 Peter M. Waterhouse and Christopher A. helliwell: Exploring Plant Genomes by RNA-induced Gene Silencing. Nature Reviews Genetics 2003, 4: 29-38.
6、 Peter Nelson, Marianthi Kirikidou, Anup Sharma, Elsa Maniataki and Zissimous Mourelatos: The microRNA world: small is mighty. TRENDS in biochemical Sciences 2003, 28(10): 534-540
7、 Ronald H.A.Plasterk: RNA silencing:The Genome’s Immune System. Science 2002, 296: 1263-1265.
8、 Thijin R.Brummelkamp and René Bernards: New tools for function mammalian cancer genetics. Nature Reviews cancer 2003, 3: 781-789.
9、 Ulrich Klahre, Patrice Crété, Sabrina A. Leuenberger, Victor A. iglesias, and Frederick Meins, Jr: high molecular weight RNAs and small interfering RNAs induce systemic posttranscriptional gene silencing in plants. PNAS 2002, 99: 11981-11986.
10、 William M. Winston, Christina Molodowitch, Craig P. Hunter: Systemic RNAi in C. elegans Requirs the Putative Transmembrane Protein SID-1. Science 2002, 295: 2456-2459.
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