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重组蛋白纯化方法---色谱分离
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发布时间：2007-01-29
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在现代生化制备技术中，色谱分离占有核心地位，可用于分离各种初级代谢产物如氨基酸、核苷酸、单糖类、有机酸、脂肪酸；次级代谢产物如生物碱、萜类、精油、糖苷、色素；各种生物大分子如蛋白质、多肽、酶、核酸、多糖。色谱方法根据分离机制的不同可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶过滤（分子筛）色谱和亲和色谱等。
第一节 吸附色谱法
吸附色谱法是指混合物随流动相通过吸附剂时，由于该吸附剂对不同物质有不同的吸附力而使混合物分离的方法。该法是最早期的一种色谱分离技术，主要应用于某些分子量不大的物质的分离提纯，个别的如羟基磷灰石也适用于生物大分子的分离提纯，应用范围比较广。
一．吸附过程的本质
吸附是表面的一个重要性质之一。任何两相都可以形成表面，其中某相或溶解在某相中的溶质，在该表面的密集现象称为吸附。在固体与气体之间、固体与液体之间、液体与气体之间都可以发生吸附现象。吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来，然后再吸附、再解吸，形成一个动态平衡。吸附色谱过程就是不断地产生吸附与解吸的矛盾统一的过程。
凡是能够将其他物质聚集到自己表面上的物质，都称为吸附剂；聚集于吸附剂表面的物质就成为吸附物。
二．硅胶
应用最为广泛的一种极性吸附剂，主要优点是化学惰性，具有较大的吸附量。硅胶的吸附活性取决于含水量，当含水量小于1%时活性最高，大于20%时吸附活性最低，一般采用含水量10-20%的硅胶。
用硅胶进行色谱分离时，要提前进行活化和纯化。纯化即降低硅胶活性，实验表明，硅胶加入4-20%水后，表面活性部位被纯化，样品溶质在吸附剂上的吸附和解吸过程加快，同时传质作用得到改善，最终柱效大幅提高。活化是指在150-195℃加热硅胶，活化覆盖有第一层小分子的硅胶，提高硅胶对样品溶质的吸附能力，其缺点是导致硅胶极性上升，产生催化反应或不可逆吸附。
此外常用的还有：1）氧化铝 分为碱性氧化铝、中性氧化铝和酸性氧化铝，其吸附活性与含水量关系很大，在一定温度下除去水分可使氧化铝活化；2）活性炭 分为粉末活性炭、颗粒活性炭和锦纶活性炭，其吸附能力在水溶液中最强，使用前一般在150℃加热4-5小时，将吸附的大部分气体除去，锦纶活性炭则在100℃以下进行。3）聚酰胺 国外称尼龙，国内称锦纶，特别适合低分子量化合物的分离，如酚、羧酸、DNP-氨基酸、醌几芳香族化合物等。4）聚苯乙烯吸附剂 5）磷酸钙 在无机吸附剂中，磷酸钙是唯一适用于生物活性高分子物质分离的吸附剂，主要用于蛋白质的色谱分离、也适用于较小分子的核酸如转运RNA。
三．吸附柱色谱的实验技术
1． 吸附剂的选择及处理
吸附剂分为无机吸附剂如硅胶、氧化铝、活性炭、氧化镁、碳酸钙、磷酸钙，有机吸附剂如纤维素、淀粉、蔗糖、聚酰胺等。一般来说，所选择吸附剂应有较大的比表面积和足够的吸附能力：对欲分离的不同物质应有不同的吸附能力，即有足够的分辨力；与洗脱剂、溶剂及样品组分不会发生化学反应；吸附剂颗粒均匀。 吸附剂一般先经过筛获得均匀的颗粒（100-200目），对含有杂质的吸附剂可用有机溶剂如甲醇、乙醇、乙酸乙酯等浸泡处理或提取除去，有些吸附剂可用沸水洗去酸碱使呈中性，有些需经加热处理活化。
2. 溶剂与洗脱剂
两者常为同一组分,但用途不同。习惯上把用于溶解样品的溶液称为溶剂，把用于洗脱洗脱柱的溶液称洗脱剂。原则上所选的溶剂和洗脱剂要求纯度高，与样品和吸附剂不起化学反应，对样品的溶解度大，粘度小，易流动，易与洗脱的组分分开。常用的溶剂和洗脱剂有饱和碳氢化合物、醇、酚、醚、卤化烷、有机酸等。
3． 柱的装填和样品的加入
色谱柱一般为玻璃或有机玻璃管制成，柱下端装上一块2-4号烧结玻璃或垫一层玻璃丝以支持吸附剂，管内装吸附剂。有条件可附加压或减压装置，使流速保持恒定，色谱柱外也可配恒温管套。
装柱的方法通常是将一种在适当溶剂中的吸附剂调成糊状，慢慢地倒入关闭了出水口的柱中，同时不断搅拌上层糊状物，赶去气泡，并使装填物均匀的自然下降，装置所需要的高度后，打开出水口，让溶剂流出。注意柱的任何部分不能流干，即是说、再柱的表面始终保持着一层溶剂。
小心地用移液管把样品液绕柱内壁小心地加入，不要冲击着吸附剂的表面。加样的另一个办法是用一个注射器和蠕动泵把样品直接送到柱表面上。
3. 洗脱
在整个洗脱过程中，要使洗脱液通过柱时保持恒定的流速，可以用调节"操作压"来调控（操作压相当于在柱上面的贮液瓶中溶剂的水平和柱出口位置的水平之差）。另一个方法是时用蠕动泵。
洗脱过程中柱内不断发生溶解（解吸），吸附，在溶解，在吸附。被吸附的物质被溶剂解吸，随着溶剂向下移动，又遇到新的吸附剂又把该物质自溶剂中吸附出来，后来流下的新溶剂又在使该物质溶解而向下移动。如此反复解析，吸附，经过一段时间后，该物质向下移动至一定距离，此距离的长短与吸附剂对该物质的吸附力及溶剂对该物质的溶解能力有关，分子结构不同的物质溶解度和吸附能力不同，移动距离也不同,吸附较弱的就易溶解，移动距离较大。经过适当时间后，各物质就形成了各种区带,，每一区带可能是一种纯物质，如果被分离物质是有色的，就可以清楚地看到色层。随着洗脱剂向下移动，最后各组份按吸附力的不同顺序流出色谱柱，以流出体积对浓度作图，可得由一系列峰组成的曲线，每一峰可能相当于一个组分。
第二节 离子交换色谱法
离子交换作用是指一个溶液中的某一种离子与一个固体中的另一种具有相同电荷的离子互相调换位置，即溶液中的离子跑到固体上去，把固体上的离子替换下来。这里,溶液称流动相，而固体称固定相.
一. 离子交换剂的类型
1． 聚苯乙烯阳离子和阴离子交换树脂
这是最重要一类离子交换树脂，由苯乙烯和二乙烯苯的共聚物作为骨架，在引入所需要的酸性基或碱性基而成。根据引入的可离解基团的性质又可分为下列两类离子交换树脂： 1)聚苯乙烯阳离子交换树脂 这类交换剂可再分为强酸型、中强酸型及弱酸性三种；2）聚苯乙烯阴离子交换树脂 也可在分为强酸性、中强酸性及弱酸性三类。
2． 聚丙烯酸阳离子交换树脂
是由甲基丙烯酸和二乙烯的聚合而成。这类树脂具高度的交换量，每棵树脂可交换10毫克当量物质。这种高度缔合的非离子化羧基使树脂的表面形成一个亲水平，对极性分子能起一种很有效的吸附作用。
3． 其它离子交换剂
1）选择性离子交换剂 是利用某些特殊的有机溶剂可与某些金属离子起选择性反应的原理而制备的。如用含汞的树脂分离含巯基的化合物（辅酶A，半胱氨酸，谷胱甘肽）。
2）吸附树脂 是一类有很大的表面积，吸附能力强，离子交换的能力很小的树脂。主要用于脱色和除去蛋白质等，也成为"脱色树脂"。
3）电子交换树脂 这类所交换的不是离子而是电子，交换反应是个氧化还原反应，也称"氧化还原树脂"。
由于上述几种离子交换剂与生化物质的分离制备关系不大，这里不作详细介绍。
二、离子交换树脂的性质
1． 一般特性
1）多孔性 树脂为疏松的，多孔的网络物质，而活性基团一般都处以树脂网孔内，外来离子必须进入网孔内才能进行离子交换。
2）不溶性 树脂在水中及稀酸、稀碱和一般有机溶剂中都不溶解，以维持其立体网状结构。
3）稳定性 离子交换树脂具有强稳定的化学性质，母体本身不与酸、碱起作用。例如强酸型阳离子交换树脂（国产732树脂）很稳定，可使用几百次，其交换能量改变不大，又可长时间浸泡于5%氢氧化钠中，1%高锰酸钾中，双氧水，0.1N硝酸，耐热性较好,可在100℃左右处理。
4）离子交换性 离子交换树脂必须具备相当数量的可交换离子或带电基团，这些离子和基团的类型决定了离子交换剂的类型，而基团的总数和他们的亲和性决定树脂的交换总量。
2． 其他特性
1）交联度 合成树脂时使用的交联剂（如二乙烯苯）在原料中总重量中所占的百分比叫做树脂的交联度。交联度的大小与树枝的膨胀性及交换量均有关系，交联度越大，树脂的网孔越小，故交换量也少；反之，交联度越小，网孔越大，孔内活性基团越多，故交换量也越大，膨胀性增大，从而易引起树脂的机械变形破损。
2）活性基团的性质 阳离子交换剂的活性基团有强酸基（-SO3）、弱酸基（-COO-）和中强酸基（PO4=）。阴离子交换剂的活性基团有强碱基（N+R3）或弱碱基（N+HR2）。在pH2以上，磺酸基完全离解，树脂有最大的交换量。弱碱性阴离子交换剂树脂在PH5以下完全离解.
3)对离子的亲和力 一般说来，电性越强，越易交换。对于阳离子树脂，在常温常压的低浓度溶液中，交换量随交换离子的电价增大而增大，如Na+<Ca++<Al+++<Ti++++; 如价数相同，则交换量随交换离子的原子序数的增加而增大，Li+<Na+<K+<Pb+<Ss+. 阴离子也有一定的规律，在常温常压下低浓度溶液中，强碱性交换树脂的各负电性基团的离子亲和力次序如下：CH3COO-<F-<OH-<HCOO<Cl-<SCN-<Br<CrO4<NO3<I-<C2O4<SO4<柠檬酸根.
三. 离子交换剂的实验技术
1. 离子交换剂的选择
在阳离子交换剂中以磺酸型应用最广，它在酸及中性溶液中均可使用，简单及复杂的无机及有机离子都可交换，但带正电荷的胶体和高分子的阳离子则不能被交换和交换很少.
2. 交换剂的处理及转型
商品的树脂是干树脂，使用前要用水浸泡使之充分吸水膨胀，又因含有一些水不溶性的杂质，故要用酸、碱处理树脂。步骤如下：干树脂用水浸泡两小时后减压抽去气泡，倾去水，用无离子水洗至澄清，倾去水后加入2N HCL,搅拌四小时，除去酸液，水洗至中性，再增加4倍量2N NaOH, 搅拌四小时，除去碱液，水洗至中性备用。
根据需要用适当的试剂，使树脂成为所需要的型式（称为转型），阳离子交换树脂用HCL处理则作为H+型，用NaOH处理则转为Na+型，用NH4OH处理为NH4+型。阴离子交换树脂用盐酸处理则专为Cl-型，用氢氧化钠和NH4OH处理为OH-型，用甲酸铵处理未甲酸型。
树脂长期使用后，如杂质含量太高，则可在上述酸碱处理前用沸水处理，或用热酸与热碱处理，甚至用有机溶剂（如乙醇、丙酮等）处理，再用水洗干净。
树脂保持以盐型较稳定。用过的树脂一定要洗干净，防止发霉。如短期存放，可保存于1N NaOH（阳树脂）和1N HCL（阴树脂）中.
3. 装柱及加样
实验室的离子交换剂一般用玻璃和有机玻璃制成，下面有缩口，管底部烧结上砂芯滤板或垫上玻璃纤维。柱的大小视需要而定，可根据被交换物资的数量和交换剂的总交换量来决定。
离子交换剂的装柱与一般色谱法相同，主要是防止出现气泡和分层，装填要均匀。防止产生气泡和分层的方法是装柱时柱内保持一定高度的水（一般为柱高的三分之一），加入树脂时使树脂借水的浮力慢慢自然沉淀。
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