五、平板胶的染色
硝酸银染色：（整个操作在摇床上进行）
（1） 固定：25ml的冰醋酸，100ml甲醇，125ml 去离子水，60 分钟。
（2） 敏化：75ml甲醇，0.5g硫代硫酸钠（使用之前加入），17g醋酸钠，165ml去离子水，30分钟。
（3） 清洗：用250ml 的去离子水清洗3 次每次5 分钟。
（4） 银染：0.625g硝酸银，250去离子水，（使用之前配制）20 分钟。
（5） 显色：6.25g碳酸钠，100vl 的甲醛（使用之前加入），250ml 去离子水。
（6） 终止：5%的醋酸。
（7） 照相分析。
（8） 保存制作干胶。
药品：
提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。
平衡缓冲液：1.5MTris－Cl ph8.8 6.7ml，尿素72.07g ，87％的甘油69ml，SDS 4g，溴酚蓝少许。溶涨液：尿素12g，CHAPS0.5g，溴酚蓝少许溶于无菌水中，总体积为25ml。使用之前再加入IPG缓冲液 0.5vl/100vl，DTT1.5vl/100vl。
制作平板胶：

分离胶的配制方法：
药品/浓度 5％ 7.5％ 10％ 12.5% 15%
丙烯酰胺 6.7ml 10ml 13.3ml 16.7ml 20ml
分离胶缓冲液 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml
10×SDS 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml
无菌水 22.7ml 19.4ml 16.1ml 12.8ml 9.5ml
10％过硫酸胺* 200vl 200vl 200vl 200vl 200vl
TEMED* 13.3vl 13.3vl 13.3vl 13.3vl 13.3vl
*在灌胶之前加入
药品配制：

丙烯酰胺单体储液：丙烯酰胺60g甲叉双丙烯酰胺1.6g溶于无菌水中总体积200ml分离胶缓冲液：Trisbase181.5g 溶于750ml 无菌水中调PH8.8总体积1000ml10％SDS：SDS5g溶于无菌水中总体积50ml10％的过硫酸胺：0.1g溶于无菌水中总体积1mlSDS 电泳缓冲液：Trisbase15.1g甘胺酸72.1gSDS5g溶于无菌水中总体积5000ml
封胶溶液：SDS电泳缓冲液100ml 琼脂糖0.5g溴酚蓝少许附：蛋白质含量测定的方法（Bradford 方法）
原理：这一方法基于2 考马斯亮蓝G－250 有红蓝两种不同的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。反应化合物在465－ 595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的
大小计算蛋白的含量。
溶液：
1）Bradford储存液
100ml95％乙醇
200ml88％磷酸
350mgServaG蓝
室温下长期保持稳定。
2）Bradford工作液
425ml双蒸水
15ml95％乙醇
30ml88％磷酸
30ml Bradford储存液
用滤纸过滤，保存于室温棕色瓶中，可保存数周，但在使用前需要过滤。
3）配制1mg/ml牛血清蛋白（BSA）
做标准曲线：


取样品即可测量。
注意事项：
1、样品的问题：

样品制备是做好2-d 的关键，这句话好象有点多余，如果样品中离子浓度过大，根本做不了2d，我开始的时候由于提取方法有问题，结果浪费了很多时间和IPG胶条，真的很心痛 呀！另外再说明一点，最好用新鲜的样品提取蛋白质，蛋白点的差异很大，新鲜的样品点多，而我用存放在-80 的样品跑出来效果差了很多呀！如果你不确定你的蛋白提的如何，建议你先跑sds-page。检验一下。关于蛋白的提取方法，我还想听听各位的建议。
2、上样量的问题，我觉得我跑的这张2D 图，上样量还需要调整，可以适当降低，我的ipg 胶条是13 厘米的上样量在50ng-80ng之间，上样量不合适，丰度低的将会被丰度高的所遮盖，这是最讨厌的问题。
3、跑一向的时候大家都差不多，根据公司的说明就可以做了。跑二向的时候我现在一般做恒压，以前做过恒流，没感觉有什么差异，还想请教各位！横流和恒压到底哪个更好一些！
4、 ipg 胶条ph 的选择，我做的是植物的花药，一般情况下酸性端点多一点，碱性端较少，我现在选用的是ph3-10 的，我觉得很不合适，（不过这个胶条是免费的）因此好多点没能很好的分开，如果胶条的ph小一点，胶条（我希望能达到18cm）可是我们这里做不了，效果 应该比这个好很多的！
5、从这块胶上，我觉得致命点就是背景深，将影响我下一步的分析。所以银染还需要改进！
6、针对不同的蛋白质，分离胶的浓度也是可以调节的，我比较懒，就作过10%，12.5%的，不过觉得都不
适合。    来源：网络