武汉大学分子遗传学笔记

3.3 原核生物染色体及其基因

原核生物和真核生物比较

第二节基因组大小与C值矛盾

第三节原核生物染色体及其基因

第四节真核生物的染色体

第五节真核生物的基因

第六节基因定位

第七节基因的分子进化

第八节早期生命进化的三界系统理论

3.5 真核生物的基因

1.真核生物基因组的一般特点

真核生物的基因组一般冉吓哟螅洞笥谠松锏幕蜃椤?br> 真核生物的DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内。

真核基因组存在着许多重复序列，重复次数可达几百万以上。

绝大多数真核生物编码蛋白质的基因为断裂基因，即结构基因是不连续排列的，中

间由插入序列隔开。

真核生物基因组中不编码的区域多于编码区域。

真核生物不仅含有核内染色体DNA，还有核外细胞器DNA、核外细胞器有线立体DNA和叶绿体DNA。

2.断裂基因（不连续基因） interrupted or discontinuous genes

SV40A蛋白基因含有一段346NT的间隔区。

每个活性珠蛋白基因含有两个间隔区。

卵清蛋白基因含有7个插入序列被分成八段。

3.基因家族与基因簇 gene family & gene cluster

定义：真核生物基因组中许多来源相同，结构相似，功能相关的基因在染色体上成

串存在，这样的一组基因称为基因家族。多基因家族是真核生物基因组织的一个重要特征。

多基因家族在基因组中的分布情况不同，有些基因成串排列集中在一条染色体上，

集中成簇的一组基因形成基因簇。也称串联重复基因（见后）。如组蛋白基因, rRNA基因, tRNA基因等。而有些基因家族成员不集中排列，而是分散在基因组的不同部位。如干扰素，珠蛋白，生长激素，SOX基因家族。

在多基因家族中，有些成员不具有任何功能，这类基因叫假基因(pseudogene)。

4.串联重复基因`

特征：

A. 各成员间有高度的序列一致性或完全相同。

B. 拷贝数高，几十个至几百个。因其在细胞中的需要量很大。

C. 非转录的间隔区短而一致。

组蛋白基因

五种组蛋白基因彼此靠近构成一个重复单位。许多这样的重复单位串联在一起，构

成组蛋白基因簇。

rRNA基因

原核生物有三种rRNA：5S，16S，23S

真核生物有四种rRNA：5.8S,18S,28S, 5S

主体rRNA：三种主体rRNA基因组成重复单位，转录出一个45SrRNA，经转录后处理切除间隔区成为18S，5.8S，28S 三种rRNA。

核仁：核中rRNA基因大量地转录成RNA，由于其染色性质与DNA不同，在光学显微镜下形成特殊的区域，这一结构，称为核仁（nucleole）。含有rDNA串联重复单位的染色体称为核仁组织者（nucleoolar organizers）。

tRNA基因

tRNA长约70-80bp，其基因约长140bp。TRNA也是串联重复排列，但个重复单位中各个tRNA基因可以相同可以不相同。

5.细胞器基因

真核生物细胞器中有两类细胞器能够携带遗传物质。

动物生殖细胞中只有卵子才有线立体基因，而精子缺乏。线立体DNA多为环状非重复DNA序列。属于核外DNA。

线粒体和叶绿体均编码自身所需的某些蛋白质以及tRNA和rRNA，其余均由核基因编码。

细胞器有自己的蛋白质合成器。只有两种rRNA。哺乳为12S和16S，酵母为18S 和21S（含有一内含子）。tRNA比核内编码的 tRNA小。酵母DNA为84kb。其上面的基因有三个特点。

哺乳动物线立体DNA不同于酵母。人体线立体基因排列非常紧密。人类线立体DNA为16.569kb。含37个基因；13个蛋白质基因；1个cytb 基因；2个ATP酶亚基基因；3个CO亚基基因（细胞色素氧化酶亚基）；7个NADH脱氢酶亚基基因；2个rRNA基因：12S rRNA、16S rRNA；22个tRNA基因

3.4 真核生物的染色体

真核生物DNA复性动力学

真核生物染色体上的单一序列和重复序列以及卫星DNA

单一序列又称非重复序列

轻度重复序列

中度重复序列

高度重复序列

卫星DNA的等级结构及其起源和进化

染色质和核小体

染色质chromatin

核小体nucleosome

着丝粒centromere

端粒telomere

第四章 DNA复制、转录与翻译

4.1 DNA复制

一. DNA的半保留复制

Watson &Crick 最早提出DNA 的半保留复制机制。即是：DNA分子的双螺旋在复制时分开，各自作为新链合成时的模板，复制后，每一个新的双链DNA 分子都是由一条亲链和一条新合成的子链组成的。合成过程中亲链和子链间严格的碱基配对是DNA复制的基础。

图示DNA复制（Meselson-Stahl实验——Cscl超离心显示不同比重DNA带）

二. 复制原点，方向和方式或DNA复制是从特定的位点开始并按特定的方向进行

实验证明，DNA分子复制时不是随机起始的，而是从特定的位点开始的，这一特定的位点叫做复制起始点或复制原点，常用ori 或o 表示。

许多生物的复制点都是DNA呼吸作用强烈的区段，即是经常开放的区段（frequently opening region ）亦即富含A，T的区段。这一区段产生瞬时单链与SSB蛋白（single-stranded DNA binding protein）结合，对复制的起始十分重要。复制从特定的位置开始，大多数双向进行，也有一些单向的或以不对称的双向方式进行。

在复制原点双链DNA解旋形成复制叉。在复制叉处，新合成的子链DNA以各自的亲链为模板，总是从5'-3'方向合成。复制叉是不对称的，即两条新合成的链中，一条链是连续合成，叫前导链（leading strand ），另一条链是在模板DNA指导下，通过一个叫DNA 引发酶的蛋白质，在特定的间隔区先合成大约10个NT 的RNA引物为DNA聚合酶提供3‘——OH，然后合成一个称之为冈崎片段的不连续的DNA片段，再经专门的DNA修复系统，去除RNA引物，再经DNA连接酶通过磷酸二酯键将其连起来，完成该子链的合成，这一条链叫后随链（lagging strand）

。依据DNA合成的起始方式，复制分为两种类型：复制叉式（包括复制）和滚环式复制又叫复制。

三. DNA复制的酶学

是一个复杂的酶学过程，需要30多种酶而后蛋白质的参与，构成复制体（replisome）

1. DNA聚合酶及其聚合反应

DNA POL是指以脱氧核苷三磷酸为底物催化合成DNA的一类酶，其催化反应为：

DNApol.DNA-OH——————》DNA-（pdN）n +n ppidNTP Mg 2+

这一原理被应用于现代技术中如PCR中的Tag酶作用机理。

所有真核生物和原核生物都有几种DNA聚合酶，这些聚合酶协同作用负责染色体DNA的复制，DNA分子的修复，核DNA的重组以及染色体外DNA的复制。

原核生物有三种DNA聚合酶，即 Pol I， Pol II，Pol III，Pol III是DNA复制的主酶。

真核生物有五种DNA聚合酶，即，，，，。，，是复制主酶，是核DNA复制的重要酶。

2. 脱氧核苷三磷酸前体的来源

有两个来源：废物利用——体内核酸降解或直接来自培养基

新合成途径——利用生物体的氨基酸，CO2，NH3和磷酸核糖焦磷酸合成核

糖核苷单磷酸（NMP）

核苷单磷酸激酶

NMP + ATP ——————————NDP + ADP

核糖核苷酸还原酶

NDP ——————————dNDP

脱掉核糖2‘上的氧

核苷二磷酸激酶

dNDP + ATP ——————————dNTP +ADP （dNTP：四种脱氧核糖核苷酸）

所有生物的核酸链的合成都是按5‘——》3‘方向进行的，无一例外。

3. 三种DNA聚合酶的结构和功能

4. DNA连接酶

DNA Pol 虽能填充缺口，但不能使缺口接合，而连接酶则能完成接合任务。

5. 与DNA几何性质有关的酶

螺旋酶（helicases）又称解旋酶，使双链DNA 分离:

C. 螺旋酶I，II，与产物单链DNA结合

F. 螺旋酶III，催化双链DNA 分离，与SSDNA结合蛋白质配合。

DNA旋转酶（Eco拓扑异构酶II）

多数天然DNA具有负超螺旋，可变为泡状单链形式，利于蛋白质结合，并可缓解复制叉前移造成的抄缠现象，但当5%的环行DNA双链已经复制时，原有的负超螺旋已被用尽，若复制叉再前移，就产生拓扑学问题，就需要拓扑异构酶来解决。在Ecoli中，主要是DNA旋转酶（Eco拓扑异构酶II），他能产生负超螺旋并消除复制叉前移产生的正超螺旋。

所以，如果加入几种DNA螺旋酶的抑制剂，如香豆霉素，新生霉素，萘啶酮酸等均能抑制细菌DNA的复制， P94 图示复制叉前移的拓扑学问题。

DNA复制的半不连续性

1. 半不连续性复制的发现

2. 引物和引发酶

DNA复制过程中，复制叉是不对称的。两条新合成的链中，一条是连续合成的，叫前导链

；另一条是在模板DNA指导下，通过一种叫DNA引发酶的蛋白质，在特定的间隔区先合成大约10个核苷酸组成的RNA引物（RNA primer）为DNA聚合酶提供3’-OH，然后合成称为冈崎片段的不连续的DNA片段，最后由DNA修复系统去除RNA引物而代之以DNA，再由DNA连接酶通过3‘5’-磷酸二酯键将其连接起来，完成此子链的合成，这条子链叫后随链。

由于DNA聚合酶在没有引物情况下不能从头合成DNA，必须有一条引物。研究发现的引物大多数为一段RNA，长度和序列随基因组的种类而异，为1-10个核苷酸见表3 P98。

该引物RNA与经典的RNA（mRNA）不同，，他们合成后不与模板分离，而是以氢键与模板结合。他可能由一种独特的RNA聚合酶所合成，这种合成RNA引物的酶旧叫引发酶。那么，前导链是如何合成的？三种可能性：1）同后随链一样，由RNA引物提供3‘-OH；

2）可能模板上的起始点产生缺口，暴露3’-OH作引物；3）可能由后随链提供3‘-OH。

3. 前体片段的连接

真核生物的DNA复制

1 真核生物的复制原点，复制元和复制元族

真核生物的DNA聚合酶活性比大肠杆菌低得多，复制速度为500bp-5000bp/分（Ecoli为105bp/分）如按哺乳动物的DNA比细菌大约50倍，真核生物DNA复制时间就会是大肠杆菌的1000倍，即约一个月，而事实上，真核生物DNA复制时间一般为几小时，这是因为通过从许多原点同时开始并双向复制而实现的。放射形自显影可见许多的复制泡。每一复制泡有固定的一点（复制原点），然后双向伸展，与相酃的复制泡会合。这样一段DNA 称为复制单元，简称复制元（replicon）。而几个复制元可组成复制元族，同一族内的复制元基本同步。

真核生物复制原点的DNA序列并无固定的模式，但大多包含一个富含AT的序列，可能还有一个特异性蛋白质的结合位点。

2 真核生物的DNA pol 和引发酶primase

与真核生物多起点复制相适应的是，细胞中DNA聚合酶的分子数目多，在Ecoli中，POLIII只有10-20个分子，而哺乳动物细胞中DNA POL 有2000-60000个分子，DNA POL 与DNA引发酶结合很紧，是复制体系必需的复合物。

实验表明，在细胞DNA合成期（S期），DNA POL 含量剧增。协同的作用，负责线立体DNA的复制，含量变化不大，与损伤DNA修复有关。

引发酶的作用：

B. 是与引发酶复合物所必需的

E. 其引物合成方式特别，阵发性合成，

F. 可利用rNTP和dNTP为合成前体。

引物一般为6-15个NT。

1 SV40以及其他真核生物的DNA复制过程

SV40所编码的蛋白质中，只有一个大T抗原参与其DNA复制，其余复制机制由寄主的蛋白质构成。大T抗原四聚体在复制原点有三个结合位点，同时还具有ATPase活性和螺旋酶活性。

SV40的DNA复制有可能代表真核生物的DNA复制的主要过程：首先由一特异的蛋白质识别复制原点并与之结合。——》再由螺旋酶促进负超螺旋状的复制原点解链——》单链DNA结合蛋白质（SSB）维持解链区并以动态左右前移——》在由POL 和引发酶与原点上的特异蛋白质相互作用，从而引发复制叉的先导链的合成；然后再印发另一先导链的合成——》随着复制叉的前进，需要拓扑异构酶解除复制叉前进造成的超缠现象。当相酃的两个复制元的相向的两个复制叉结合时就完成了这一段DNA的复制，可能并不存在固定的终止序列。而真核生物染色体末端DNA的复制却不那么简单。见后。

2 真核生物染色体末端DNA的复制

由于RNA引物的水解，两个子代分子中各有一个5‘端缺少一段核苷酸，而没有一个目前已知的DNA POL能填补。

腺病毒DNA的5‘末端共价连接一个55kD的蛋白质，即末端蛋白质（Terminal Protein TP）,而正在复制的腺病毒新生的DNA 5‘端为80kD的蛋白质，为末端蛋白质前体（pTP），这一引发方式避免了线性DNA在复制结束后的5’末端隐缩问题。真核生物同样面临线性DNA复制结束时产生的5‘末端隐缩问题。这个问题的解决取决于端粒的结构和能够识别和结合端粒的蛋白和酶。

四膜虫端粒中有一种端粒酶（）能将其端粒结构中单链尾巴5‘TTGGGG3’延长，延长的部分仍是5‘TTGGGG3’，这一富含G的序列总是突出12-16个NT。这种酶是一种核糖核蛋白，由RNA和蛋白质组成。有人证明该酶中的RNA是富含G序列的模板，对拷贝出富含G序列所必需的部分为5‘CAAAACCCCAAAA3’，此RNA可能还有其他作用，这单链尾巴可能弯转成为引物复制5‘末端，另一可能是某种端粒蛋白结合末端的单链重复序列，并作为蛋白质引物复制DNA地’末端。

复制的调控

DNA复制是受调控的，细胞分裂时间因营养条件变化很大（21-70分钟/Ecoli），而DNA复制时间为40分钟左右，可用成熟前起始加以解释细胞分裂时间为21分钟的DNA复制。

DNA复制调控，可能涉及许多专一性的蛋白因子（Ecoli Dna A,SV40 大T抗原等）和至少一类RNA分子（RNA2，RNA1）。细胞中蛋白质和DNA总量的比例也可能是一重要因素，因为氨基酸饥饿时会抑制蛋白质合成和DNA复制起始。

在此说明一下RNA2和RNA1：

大肠杆菌质粒Col E1的复制需要一种RNA引物，RNA POL从复制原点上游方向555bp处转录，这个转录物就是RNA2。 RNA2延伸至复制原点区域时，由RNAaseH 将RNA与DNA模板形成的杂合双链中的RNA切断，从而产生3’-OH末端，然后，DNA POL以此引物合成DNA。图示P130。

在ColE1复制原点上游方向445bp处（相当于RNA2的第111个碱基位置），起始转录另一个RNA分子，即是RNA1，其转录方向与RNA2相反。这个反义的RNA1有111个碱基与RNA2的5’末端互补，从而改变了RNA2的二级结构使之不能为RNAaseH（识别杂交双链但不识别二级结构）所识别，于是，RNA2的转录能够继续进行，而不能在复制原点区域RNA。有些机理有待继续探讨

4.2 转录

一概述

三类RNA都必须以DNA模板，在依赖于DNA的RNA POL作用下合成，他包括RNA链的起始，延

伸，终止等步骤，这一系列过程叫转录。

转录是基因表达的第一步，也是最关键的一步。

转录涉及两个方面

一是RNA合成的酶学过程

二是RNA合成的起始信号和终止，即DNA上的特定序列。

DNA和RNA的碱基序列方向总是5'-3'。

阐述几个概念：

对DNA总是讲模板链，在转录时DNA两条链有混乱不一。新文献规定：

把不作模板转录的链称为有义链（sense）又称编码链（coding）,非模板链=RNA链=有义链而把作为模板转录的链称反义链（antisense strand）或模板链,模板=反义链。

对RNA，也容易将DNA序列直接与氨基酸的密码子联系起来：

SSDNA phage 如ΦX174，其SSDNA作为复制模板进入细胞后复制合成互补DNA，后者（互补DNA）作为转录模板（即反义链）合成RNA。即SSDNA=有义链=RNA序列=正链对于SSRNA病毒，若其基因组RNA能作为mRNA或与mRNA相同，则该RNA病毒为正链RNA病毒；若其RNA进入宿主需要进行RNA复制，再产生互补链作为mRNA，则这种RNA称为负链RNA病毒。

二 RNA合成的酶学

1. RNA合成的基本特征

1) RNA的前体是四种核糖核苷三磷酸（rNTP）：ATP， GTP， CTP，UTP

2) RNA链的生长方向也是5’— 3’

3) 核苷三磷加到新生链的3'，同时除去一分子焦磷酸而生成磷酸二酯键。

4) 转录必须以一条DNA链为模板，按碱基互补进行转录。

5) RNA POL能起始一条新链的合成，起始的核苷酸一般是嘌呤核苷三磷酸（XTP）RNA合成含四步：RNA POL结合于DNA上的特定位点，起始，链的延长，链终止和释放。

2. E Coli 和真核生物的RNA POL（自己看）`

三控制转录起始的DNA序列——操作子和启动子结构

1. 操纵元（operon）及其结构

操纵元：包括结构基因和控制区以及调节基因的整个核苷酸序列。

控制区为两部分：

1) 从结构基因溯流而上的紧靠结构基因的部分叫操作子（operator）（即结构基因的5’上游），好比电器开关，控制其后面的全部结构基因的开闭。

2) 从操作子逆行而上的就是另一控制区域，叫启动子（promoter）对转录非常重要。

2. 原核生物的启动子

1) Pribnow 框：—10bp处，是RNA POL 结合位点

2) Sextama 框：—35bp处，RNA pol 先结合与此处，再结合于—10bp处。

3) CAP位点：CAP为环腺苷酸受体蛋白（cyclic AMP receptor）。调节基因产生的阻遏蛋白与操纵子以及诱导物互作实现对基因转录的负调控；而葡萄糖的调控机理则为正调控。

3. 真核生物的启动子

真核生物有三种RNA POL：

POL I：负责转录rRNA，只有一种启动子。

POL II：负责蛋白质基因和部分snRNA基因的转录，启动子最复杂。

POL III：负责转录tRNA和5S rRNA，启动子位于转录的DNA序列内（内部启动子）。

1) RNA POL I的启动子

2) RNA POL II 的启动子结构

A. 帽子位点

B. TATA框：

C. CAAT框

D. 增强子

3) RNA POL III的下游启动子

第五章基因工程

5.1 基因工程的四大要素及其实施要点

1.工具酶

1)限制性内切酶

2)连接酶

3)修饰酶

4)DNA聚合酶：

A. DNA聚合酶I；

B. Klenow fragment

C. T4 or T7 DNA polymerase

D. Taq DNA polymerase

E. RT: 依赖RNA的 DNA polymerase

5)依赖于DNA的RNA聚合酶

6)T4噬菌体多核苷酸激酶TK：磷酸化

7)碱性磷酸酶:脱磷酸

细菌碱性磷酸酶(B. Alkaline Phosphatase)

小牛肠碱性磷酸酶(Calf intestinal Phosphatase)

2.目的基因的分离方法及其用途

分离方法

基因分离的物理化学方法

鸟枪法

cDNA文库的建立与基因的分离

直接从特定的mRNA中分离基因

基因组文库的建立和基因的分离

从蛋白质入手分离编码此蛋白的基因

基因的化学合成

利用PCR or RT-PCR分离基因

用途

研究该基因的全貌与内涵，如详细分析其结构，功能及其调控

与正常基因对比，寻找异常基因的异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机理及治疗

对策

研究生物种系进化与相关同源性

应用某种基因的大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽

改良某些目的基因，以改良品种

建立基因疗法。选用某终；颍牖颊咛迥冢瘟颇承┫忍煨砸糯膊　?/div>

3.基因工程载体

一、定义

二、载体具备3 的条件：

三、载体的种类：

质粒载体

细菌用的表达载体

λ载体

粘粒载体

M13噬菌体载体

真核细胞用载体

人工染色体（YAC，8 BAC，9 PAC，10 MAC）

4.受体细胞和重组基因的导入

5.基因重组的方法与策略

6.基因重组体的筛选

5.2 聚合酶链式反应（PCR

第一节 PCR基本原理和影响因素

　　1983年美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应(polymerase chain re

action，PCR)，1985年公开报道，使人们能在试管内以几小时的反应将DNA扩增10^9倍。

1987年PCR得到美国的专利权，PCR技术在生命科学中掀起了一场革命，并形成了巨大的市场，有人预言，本世纪末PCR产值可达到4x10^8美元。本章介绍PCR的原理、常用的各种PCR方法及主要应用范围。

　　一、基本原理

　　DNA在细胞中的复制是—个比较复杂的过程。参与复制的基本因素有：DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA模板、由引发酶合成的RNA引物、核苷酸原料、无机离子、合适的pH、以及解开DNA的超螺旋及双螺旋等结构的若干酶与蛋白质因子等。

　　PCR是在试管中进行DNA复制反应，基本原理与体内相似，不同之处是耐热的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加热(变性)、冷却(退火、保温(延伸)等改变温度的办法使DNA得以复制，反复进行变性、退火、延伸循环，就可使DNA无限扩增。PCR的具体过程如下：

　　将PCR反应体系升温至95℃左右，双链的DNA模板就解开成两条单链，此过程为变性。然后将温度降至引物的Km值以下，3'端与5'端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域结合，此过程称为退火。当将反应体系的温度升至70℃左右时，耐热的Taq DNA聚合酶催化四种脱氧核糖核苷酸按照模板DNA的核苷酸序列的互补方式依次加至引物的3'端，形成新生的DNA链。每一次循环使反应体系中的DNA分子数增加约一倍。理论上循环几次，就增加为2^n倍。当经30次循环后，DNA产量达2^30拷贝，约为10^9个拷贝。PCR扩增过程见图8-1。由于实际上扩增效率达不到2倍，因而应为（1+R）^n，R为扩增效率。

　　二、参与PCR反应体系的因素及其作用

　　参与PCR反应的因素主要包括模板核酸、引物、TaqDNA聚合酶、缓冲液、Mg2+、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、反应温度与循环次数、PCR仪等。现对它们的作用介绍如下：

　　(一)模板核酸

　　用于PCR的模板核酸可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，首先要进行反转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。核酸模板来源广泛，可以从培养细胞、细菌、病毒、组织、病理标本、考古标本等中提取。

　　PCR反应时加入的DNA模板量一般为100-100000拷贝，现在的技术水平已能从单个细胞制备出相应的cDNA文库。DNA模板含量合适，可以减少PCR多次循环带来的碱基错配。

　　通常模板DNA用线性DNA分子，若为环状质粒，最好先用酶将其切开成线状分子，因为环状DNA复性太快。

　　(二)引物

　　引物决定PCR扩增产物的特异性与长度。因此，引物设计决定PCR反应的成败。

　　PCR反应中有两种引物，即5'端引物与3'端引物。5'端引物是指与模板5'端序列相同的寡核苷酸，3'端引物是指与模板3'端序列互补的寡核苷酸。对引物的基本要求有：①引物的长度过短会影响PCR的特异性，要求有16-30bp，因为4^16=4.29x10^9，已大于哺乳动物基因组3x10^9bp，保证了特异性结合；引物过长使延伸温度超过Taq DNA聚合酶的最适温度(74度)，亦会影响产物的特异性。②G+C的含量一般为40％-60％。③四种碱基应随机分布，不要有连续3个以上的相同嘌吟或嘧啶存在。尤其是引物3'端，不应有连续3个G或c，否则会使引物与核酸的G或c富集区错误互补，而影响PCR的特异性。④引物自身不应存在互补序列而引起自身折叠，起码引物自身连续互补碱基不能大于3bp。⑤两引物之间不应互补，尤其是它们的3'端不应互补。一对引物之间不应多于4个连续碱基有互补性，以免产生引物二聚体。④引物与非特异靶区之间的同源性不要超过70％或有连续8个互补碱基同源，否则导致非特异性扩增。①引物3'端是引发延伸的点。因此不应错配。由于ATCG引起错配有一定规律，以引物3'端A影响最大，因此，尽量避免在引物3'端第一位碱基是A。引物3'端也不要是编码密码子的第三个碱基，以免因为密码子第3位简并性而影响扩增特异性。⑧引物5'端可以修饰，包括加酶切位点，用生物素、荧光物质、地高辛等标记，引入突变位点，引入启动子序列，引入蛋白质结合DNA序列等，引物的设计最好以电脑软件进行指导。

　　反应体系中，引物浓度一般要求在O.1-0.5μmol之间。浓度太高，容易生成引物二聚体，或非特异性产物。

　　引物Tm值与退火温度有关，计算公式为：Tm=4(G+C)+2(A+T)。引物Tm值最好在55-80℃范围，以接近72℃为最好。

　　(三)耐热的TaqDNA聚合酶

　　1976年Chien分离出热稳定聚合酶，1986年Erlich分离并纯化了适于PCR的Tq热稳定性聚合酶，为PCR成为实用技术奠定了基础，现已用基因重组生产。日前可用于PCR的聚合酶有多种：有从水生栖热菌中提取的Taq酶、从嗜热栖热苗中获得的Taq酶、从Litoralis栖热球菌中分离的VENT酶、及从酸热浴硫化裂片苗中分离的Sac酶，而以Taq酶用得最广泛。Taq DNA聚合酶分子量为94kD，75℃时酶比活性为150bs/酶分子，反应温度过高或过低均影响其延伸率，Taq蕾有很高的耐热稳定性。实验表明，在92.5℃、95℃、97.5℃时，其半衰期分别为40min、30min和5min。

　　纯化的Taq酶在体外无3'-5'外切酶活性，因而无校正阅读功能，在扩增过程可引起错配。错配碱基的数量受温度、Mg2+浓度和循环次数的影响。通常，30次循环Taq酶的错配率约为0.25％，高于Klenow酶的错配率。Taq酶在每一次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000。应用低浓度的dNTP(各20μmol／L)、1.5mmol/L的Mg2+浓度、高于55℃的复性温度，可提高Taq酶的忠实性，此时的平均错配率仅为5x10^-6次/（核苷酸*循环）。

　　Taq酶具有类似于末端转移酶的TdT的活性，可在新生成的双链产物的3'端加上—个碱基，尤其是dATP最容易加上。因此，欲将PCR产物克隆到载体上，可以用两种处理办法：一是构建dT-载体；二是用Klenow酶将3'端的A去掉，即在PCR反应后，先在99℃加热10min灭活Taq酶，调整Mg2+浓度至5-10mmol/L，加入1-2U Klenow片段，室温下作用15-20min，3'端的A即被切去，

　　Taq酶还具有反转录活性。在2-3mmol/L Mg2+浓度下68℃时出现类似反转录酶的活性。若有Mg2+存在，则反转录活性更佳，利用这一活性，可直接用于RNA-PCR，尤其是短片段的扩增。

　　以往用Taq酶进行PCR扩增，一般只能扩增小于400bp的DNA片段，经过对酶的结构与功能的改造，以及PCR方法学的改进，现已能扩增20kb以上的DNA分于。

　　Taq酶在PCR反应中加入的量也很重要，太少当然不好，太多一方面浪费，同时也导致非特异性扩增，通常每lOOμl反应液中含1-2.5U Taq酶为好。最好在0.5-5U范围内确定最佳酶浓度。另一个问题是，虽然Taq酶是热稳定性较好的工具酶，也应注意在-20℃贮存。

　　(四)缓冲液

　　缓冲液提供PCR反应合适的酸碱度与某些离子，常用10-50mmol/L。Tris-HCI(pH8.3-8.8)缓冲液。缓冲液中含有50mmol/L KCl有利于引物的退火。有人并加入小牛血清白蛋白(100μg/L)或明胶(0.0％)或Twen20(0.05％-0.1％)或二硫基苏糖醇(DDT，5mmol/L)等，认为这些物质可以保护Taq酶。

　　(五)Mg2+Taq酶的活性需要Mg2+。Mg2+浓度过低，Taq酶活力显暑降低；Mg2+浓度过高，又使酶催化非特异性扩增。Mg2+浓度还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、引物二聚体的生成等。Taq酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关，而PCR反应体系中，dNTP、引物、DNA模板等中的所有磷酸基团均可与Mg2+结合而降低Mg2+的游离浓度。因此，Mg2+的总量应比dNTP的浓度高0.2-0.25mmol/L。如果反应体系中含有EDTA等螯合剂，也可结合掉一部分Mg2+。

　　为了获得Mg2+的最佳浓度，可用下面的优化法。首先在PCR缓冲液小不加入Mg2+，从配置的10mmol/L的Mg2+储存液中取一定量加入到各反应管中，开始以0.5mmol/L的浓度梯度递增(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,……5.0mmol/L)，由PCR反应后的电泳结果可确定Mg2+大概浓度范围，再在该浓度的上下以0.2mmol/L递增与递减几个浓度来精确确定Mg2+最适浓度。

　　(六)dNTP

　　dNTP为PCR反应的合成原料。每种dNTP浓度应相等，通常的浓度范围为20-200gmol/L，在此范围内，PCR产物的量、反应的特异性与忠实性之间的平衡最佳。例如，当每种dNTP为20μmol/L时，理论上可以产生2.6μg的400bp的DNA。使四种dNTP的浓度保持在其Km值(10-15μmol/L)以上，可保持碱基掺入的忠实性；若dNTP的浓度大于50mmol/L，则可抑制Taq酶的活性。

　　(七)反应温度和循环次数

　　1．变性温度与时间

　　PCR反应中变性这一步很重要，若不能使模板DNA和PCR产物完全变性，PCR反应就不能成功，DNA分子中G+C含量愈多，要求的变性温度愈高。太高的变性温度和时间又会影响Taq酶的活性，通常的变性温度和时间分别为95℃、30s，有时用97℃、15s。虽然DNA链在变性温度时两链分离只需几秒钟，但反应管内部达到所需温度还需要一定的时间，团此要适当延长时间。为了保证模板DNA能彻底变性．最好为7-10min，然后在以后的循环中，将变性步骤设为95℃/min。

　　扩增100-300bp短片段时，还呵以用快速的两步PCR法，即变性(94-97℃)、退火及延长(55-75℃)。

　　为防止在变性温度时反应液的蒸发，可在反应管内加入1-2滴液体石蜡。

　　2．复性温度和时间

　　复性温度决定PCR的特异性，合适的复性温度应低于引物Tm值的5℃。退火温度过低，引起非特异性扩增；增高退火温度，可提高扩增的特异性，因此要严格规定退火温度。退火反应时间一般为1min。

　　在PCR开始的头一次循环时，反应从远低于Tm值的温度开温，由于Taq酶在低温时仍具有活性，这时就可能因引物与模板非特异性配对面出现非特异性产物或出现引物二聚体然后在以后整个PCR反应中，非特异性产物反复扩增，而使PCR严重失败。为了尽量消除这种非特异性扩增，可以使用热起动的方式，热起动方法有几种：一种方法是在PCR系统中加入抗Taq酶抗体。抗体与Taq酶结合，使Taq酶活性受抑制。因此在开始时，虽然温度低，引物可与与模板错配，但因Taq酶没有活性，不会引起非特异性扩增；当进行热变性时，抗体在高温时失活，Taq酶被释放，就可发挥作用，在以后的延伸步骤进行特

异的DNA聚合反应。另一种热起动法是用石蜡将Taq酶与PCR反应系统分隔，因此一开始在室温条件下也没有非特异性扩增。当升温到热变性温度下，石蜡熔化，Taq酶与PCR反面系统混合，从而在以后的步骤中发挥作用。使用热起动可以提高PCR扩增的特异性。

　　3．延伸温度与时间

　　延伸温度一般为72℃左右，此时Taq酶活性为每秒钟掺入核苷酸35-100个，2kb的片段用1min已足够，若DNA片段较长，扩增时间可适当延长。延伸时间过长又可引起非特异性扩增。

　　4．循环次数

　　循环次数主要取决于最初靶分子的浓度，例如在初始靶分子为3x10^5、1.5x10^4、1x10^3和50拷贝数时，循环数可分别为25-30、30-35、35-40从40-45。过多的循环次数会增加非特异性产物量及碱基错配数。PCR反应后期，扩增产物的增加并不成为指数方式，称为平台效应。平台效应可能与下列因素有关：dNTP与引物浓度降低，酶对模板的比例相对降低，多次循环后酶活力降低，产物浓度增高后变性不完全而影响引物延伸。

　　(八)PCR仪

　　有多种进口与国产PCR仪。仪器的升降温方式可有气体加温、水加温及电热块加温等。温度、循环次数及时间等参数现多用电脑控制。可根据需要选择仪器。

　　由于PCR方法高度灵敏，少量的靶分子即可扩增至无限数。因此要防止PCR扩增产物污染环境而引起以后的PCR假阳性。为此，应将PCR仪及PCR产物检测等过程与标本制备及PCR反应管的制备尽量在空间分开，最好在不同的房间进行。通常可将实验空间分为标本处理区、反应混合制备和PCR扩增区、产物分析区等。`

第二节常用的几种PCR反应

　　PCR问世后，由于其很高的实用性而被广泛采用。而方法本身又在使用中不断地得到创新与发展，形成了一系列的适用于不同目的的特殊方法。现将常用的几种介绍如下。

　　一、反转录PCR(RTPCR)

　　二、定量PCR

　　三、碱基替代PCR

　　四、彩色PCR

　　五、重组PCR

　　六、不对称PCR

　　七、膜结合PCR

　　八、固着PCR

　　九、原位PCR

　　十、反向PCR

第三节 PCR在分子生物学中的应用

　　一、用PCR制备cDNA文库与筛选

　　二、PCR直接测序法

　　三、PCR用于染色体区带特异片段克隆

　　（一）随机引物PCR

　　（二）散在重复序列PCR

　　四、检测突变碱基

　　五、用简并引物法扩增未知序列

　　六、用PCR标记DNA探针

　　七、PCR与新基因的寻找

第四节 PCR在临床医学中的应用

　　一、病原体检查

　　二、遗传病的基因诊断

　　三、肿瘤的诊断、转移确定

　　四、PCR用于组织器官移植的配型选择

5.3 基因芯片分析技术

一、基因芯片分析技术

1 基因酒母拍?br> 基因芯片，亦指DNA微阵列，是将大量DNA片段有规则地固定在某种介质上，从而检测特定基因表达地一项技术。这项技术的基本原理是分子生物学中常用的杂交方法的扩展，其基本做法是将要检测的样品加以标记，然后与做成的阵块进行充分杂交，再加以洗脱后，用图像显示出结果。这里，在阵块中排列的DNA片段应是已知的序列。根据这种概念，我们可以看出，在这项技术中，有如下三点是非常关键的。

其一，要有大量已知序列和基因片段。随着人类基固组计划的实施，我们可以得到

大量基因序列信息，可以将一个文库的所有cDNA序列测到并加以记录，从而可以将一个文库排列成一个DNA阵列。因此，从理论上讲，可以做成从微生物到人类各组织器官的文库阵列。其二，从工艺的角度讲，要求能够将不同的DNA片段以很高的密度“点印”在普通载载玻片大小的介质上，从而使得在很小的面积上可以排列成千上万个基因而不致于相互混杂，这个过程要求相当高水干的工艺技术。其三，要有—种很好的检测手段。目前看来，用不同的荧光标记核酸来进行检测是一种比较简单，而且安全可靠的方法。同时，不同的荧光可以使得我们同时检测几种样品。这样，对于差异显示这类实验来说，就显得尤为简便。

基因芯片一股可分为两处，一种为“点印”阵列，一种为直接合成阵列。“点印”

阵列是将较大的片段（大于100bp）物理地固定在介质上，而直接合成阵列则是直接在介质上合成较短的片段。一般而言，DNA样本都是收集在96孔或384孔板上，这些样本可以是PCR产物，也可以是从质粒上直接得到的片段等。然后用机械手将DNA通过特制的加样头进行点样。点样完成后，对介质进行处理以使DNA能够十分稳定地附着在介质上，同时还要使介质尽量减少结合非特异性的探针。

2 基因芯片的操作过程

基因芯片制作从准备探针(即扩增DNA片段)开始，经过芯片加工、DNA阵列点印、芯片后处理及芯片质量检测等过程，其应用包括RNA制备、标记、杂交及成像分析。因此．基因芯片的应用包括了制作工艺过程和基因表达分析过程。

2.1 准备DNA 作为基因分析，DNA片段是最基本的材料，也是基因芯片制作的关键。对于不同的阵列，可以选择不同的目的BNA。

2.1.1 目的DNA的选择对于大规模地研究基因表达问题，需要分析每一个基因的表

达。因此，选择的目的 DNA必须能够代表要研究的各个基因。对于整个基因组序列全部已知的生物，最直接的方法是用PCR扩增基因组中每个已知的或预测的开放阅读框架(open reading frame)，亦可以选择自己感兴趣的部分序列。

对于没有测序，或只有部分测序的基因组，或者对于那些有大量内含子的基因组，

上述方法就不现实。在这种情况下，我们首先考虑采用表达序列标记(EST)。可以将单个EST的cDNA克隆用作阵列DNA来源。对于还没有基因组测序计划或序列还未知的生物，可以利用DNA文库作为DNA来源。当然这种文库最好是经过归整化处理，以减少不必要的冗余。

用作阵列的DNA可以呈双链的，亦可以是单链的。但是其长度最好是小于开放阅读框架，或小于1 000bp的cDNA。这对于很多具有同源性的基因尤为重要。当基团之间具有很高同源性时，最好选择基因之间有差异的部分，这样便可以提高基因之间的分辨度。所以，在考虑每个基因代表性的同时，应充分考虑所研究问题的具体情况。

2.1.2 PCR扩增一般而言，100μl PCR反应体系得到的产物足以点印1000个基因芯

片。PCR通常是在96孔PCR仪上进行，实际扩增的反应条件要根据所用的模板从引物来确定。但要尽量减少PGR反应体系中的组分，尽量只用模板、引物、核苷酸、镁离子、标准缓冲液和酶。不要用甘油或明胶，它们往往会粘附在阵列块上而影响以后的点样工作。

2.1.3 点样前DNA准备点样以前，要将PCR产物清洗纯化干净，并且对DNA进行一些处理，一般用异丙醇沉淀PCR产物，以除去酶、离子及核苷酸等。沉淀后用70％乙醇洗1次，再用95%乙醇洗1次，待完全干燥后，将所沉淀DNA重溶在3XSSC中，其浓度掌握在100ng/μl 左右。由于处理的样本量很大，一般直接在96孔板上操作，可选用能够配置96孔板的离心机（如Savant Speed Vac Plus SC210A）。当把DNA溶于10～15μl 3×SSC(pH7.0)中后，最好置于4℃至少12h。然后，将DNA溶液封存在 -20℃～4℃。

当然，纯化DNA的方法多种多样，使用者可以根据自己的情况选用。在此应当强调的是，在最后得到的DNA样本中，应尽量减少其它污染，尽量除去盐类、去污剂、甘油、明胶以及树脂颗粒等。具体实践中，应当用小规模DNA样品进行点样测试．待确定效果后，再大规模制作。

2.2 准备载物片载物片是要将DNA点上去的支撑物，有不同的材料，通常用载玻片

。DNA并不能直接固定在玻璃表面，固此需要对玻璃表面进行处理。有很多方法可以处理玻璃表面，但是我们认为用多聚-L-赖氨酸比较简单可靠．

首先充分清洗载玻片，用25XNaOH溶液200ml加300mi 95％乙醇配成500ml碱性清洗液，将载玻片彻底浸泡在清洗液中2h，再用清水冲洗5遍井将载玻片泡在水中。接下来就是用多聚-L-赖氨酸溶液浸泡，从而使多聚赖氨酸均匀涂包在玻璃表面，形成一种多聚-L-赖氨酸涂面。具体做法是配成350mI多聚-L-赖氨酸浸泡液，将洗净的载玻片直接浸泡，浸泡期间保持慢速摇晃，Ih后取出并在水中浸泡清洗，最后干燥。一般将涂好的载玻片用锡箔纸包好，室温放置1个月，进行熟化，以使表面保持充分的疏水性。这对于以后点DNA样品是十分重要的。

2.3 基因芯片的点印点印DNA用机械手。将一组处理好的载玻片固定在一个平台上

，将DNA样品(溶在3XSSC中)装在96孔或384孔的平板中，并将平板放在支架上。机械手将一组特制的点样吸头插入对应的DNA平板孔中，让每个吸头充上约1μl的DNA溶液。然后机械手轻轻地将吸头移向载玻片，将DNA样品完全一致地点到多聚-L-赖氨酸包被的载玻片面上．每个载玻片上大约点<0.5μl的DNA溶液，故理论上一次可以点印2 000个载玻片。待这一组DNA样品点印完成，机械手清洗点样吸头，开始第二批样品的点印。点样的质量要表现在点与点的距离，这取决于点样吸头的尖锐度与多聚-L-赖氨酸表面的疏水性。—般情况下两个点中央间距为100μm，点间空100μm。如果点间空为200μm，就可以把整个酵母基因组点印在1.8cm2大的面积上；如果点间空为100μm，可以把人类75 000个基因全部点在一张2．54cmX7．62cm的普通载玻片上。目前，每个点样循环持续大约为2rmin，包括清洗、干燥、加样和点样，一般点110张片子。如果增加点样吸头数，可以缩短点样时间。如将点样吸头增加到32个，则完成110个载玻片的所有人类基因点样工作约需2天时间。

2.4 基因芯片的后加工处理当一个基因芯片点成之后，需要对其进行进一步的加工

处理，以便能够用于以后的杂交实验。通常进行四步处理，即重新水合化及快速干燥、UV-交联、封闭及变性。

2.4.1 重新水合化通常点样过程并不能保证DNA在点中均匀一致。为使DNA在所有点中都分布均匀．需要对之进行重新水和化并进行快速干燥。这一过程要求技术条件很高。当重新水合化不充分时，大小不规则的点会影响以后的杂交与分析结果。但当过度水合化时，点与点之间可能会产生融合。因此，要确定一个十分准确的水合条件，一般用蒸汽熏润，其时间、温度需要摸索。

2.4.2 UV交联当重新水合化并立即干燥后，将载玻片放在UV射线下照射，这样可以使DNA交联在载玻片上。这一过程对于DNA浓度低时尤为重要，可以增加可杂交DNA吸附到每一个点上的量．在UV交联时，将载玻片有DNA点的面朝上，照射总能量强度为60mJ即可。

2.4.3 封闭封闭的主要目的是将游离赖氨酸基团加以修饰，以避免这些基团与以后

被标记的DNA结合。如果不对载玻片封闭，那么，将来杂交后就会产生无法分清的非特异杂交斑．而且还会产生过多的背景。一般的封闭办法是用琥珀酸酐进行酰基化，将赖氨酸的氨基转化成酰氨基，使之形成负电荷表面，从而减小与DNA的非特异结合．这一过程一般在15min内结束。

2.4.4 变性处理当封闭过程完成后，要立即进行变性处理，即将整个载玻片立即浸

入沸腾但不冒泡的水中，上下翻3～5次，停留2min，然后立即转到95%的乙醇中，浸泡一会儿后离心干燥，这样便完成了对芯片上DNA的变性处理。此时，整个基因芯片块也就做好了。

3 基因芯片的使用

基因芯片块制作好后，关键就是用它来完成特殊的实验。其基木原理就是将研究的

细胞或组织RNA加以标记，与基因芯片块上所点印的基因片段进行杂交，从而探测特定基因的表达。

3.1 准备探针与传统的Northen Blot正好相反，这里我们将所以表达的RNA作为探

针来源。所以探针的准备工作要包括RNA的提取和标记。

3.1.1 RNA的提取提取RNA的方法很多。现在市场上有很多提取RNA的试剂盒，用起来十分方便。不管用什么方法，提取RNA的质量和产量是问题的关键。对于研究基因表达的实验来说，最好应用纯化mRNA作为反转录模板。如果用荧光cDNA探针，需要至少1μg的mRNA或100μg总RNA。

3.1.2 标记从RNA制作标记探针，其方法有好几种，最多情况是在Oligo-dT引物进

行的逆转录反应中直接掺入荧光素标记的核苷酸。有时候也可以用随机引物cDNA合成法标记。一般基因芯片中片段来自基因3'端时较适宜用Oligo-dT引物cDNA探针，而基因芯片中片段来自全长cDNA序列或预期开放阅读框架时用两种方法均可。亦可在第一链cDNA合成后再行标记。关于两种标记方法可参考有关手册。

3.1.3 荧光染料目前市场上可以买到许多荧光染料标记的脱氧核苷酸，特别是用C

y3和Cy5标记的dUTP。这两种染料在光谱上分得很开，而且对于许多酶都有较高而特异的掺合活性。当干燥后，荧光强度很亮，可以放大成像效果。除此之外，R110(Pekin Elmer)，TAMRA(Pekin Elmer)和Spectrum Orange(Vysis)的效果也比较好。

3.2 杂交反应与昔通的Northern Blot相比，基因芯片杂交反应过程显得十分简便

。即将标记好的探针样品经高速离心去除一切沉淀物后只用移液器滴在基因芯片的中央即可。在其过程中应尽量避免产生气泡及带进沉淀杂质。滴好后在载玻片DNA阵列部位上方放一盖玻片，然后在周围滴上3滴5μl的3XSSC溶液以保持杂交池中的湿度。最后将载玻片用塑料膜包起来放到65℃水溶中杂交4~1 6h。

3.3 杂交后处理和Northern Blot一佯，杂交完成后要进行清洗，以除去剩余的探

针。清洗的方法是用2XSSC、0.1%SDS溶液浸泡，然后用1×SSC浸泡，最后再用0.2XSSC清洗。但是，应当注意，整个清洗过程都在室温下进行。清洗的时间也要严格把握。

3.4 试验设计由于基因芯片可以容纳很多信息，所以在使用时要充分考虑试验设计，要合理设计各种对照，以便在分析结果时能得出正确的结论。

3.4.1 异种RNA平行实验为了检测探针标记等过程，可以利用异种生物的RNA进行平行实验。对于人类基因阵列，可以用酵母的基因进行平行实验。选择异种基因时应避免与所研究基因有同源性，从而不致于产生杂交，但要求在DNA性质上(如GC含量、长度、poly-A尾端等)基本相似。可以选择上百个这样的异种基因，点印在所研究的阵列上。将这些基因除了点印在阵列块上以外，还要将它们克隆到带有噬菌体RNA聚合酶结合位点及人工poly-A尾端的质粒上，从而扩增大量的RNA。利用这种RNA作对照，分别标记Cy3和Cy5，可以检测正式实验中Cy3与Cy5的比值，亦可检测杂交的反应程度，同时还可作为输入输出比率的校正以及分析的灵敏度。

3.4.2 RNA质量检测对照一定核酸序列的DNA片段与相应基因结合的量，受其共同区域大小的影响。因此，对于一定的cDNA进行杂交。时的信号强度，就会因RNA的质量而发生变化。这就会使基因芯片杂交的结果产生混淆。例如，当RNA质量不同时，由之合成的相同量的cDNA在比较时就会产生明显差异，在分析时就不能得到1:1的比率。这个问题可通用选择合适的序列片段来解决。例如，用Oligo-

dT引物cDNA探针时。如将序列片段限定在基因的3' 端，就可防止产生偏差。一般可以按照下列方法来检测RNA的质量。将—个整个基因按100-200bp分段，每一段都点印在蛐酒樯希缓笤咏徊煌稲NA后检测该基因的信号。如果RNA在某一区段降解时，就不能检测到该区段的信号，由此可以断定所用RNA的质量。亦可用以上平行实验中的RNA在每一步来检测该基因各个片段的表达，从而确定各个步骤中RNA是否降解。这里最关键的几步是收获细胞、mRNA分离提纯、探针标记和杂交。

3.4.3 封闭对照和Northern Blot一样，许多杂交反应需要加入未标记的DNA来封闭由于探针与目标片段相似性而引起的非特异性结合．这对于重复性的区段更为重要。可以设一个封闭对照来检测这种非特异结合被封闭的程度。例如，在人的基因芯片中，可以用cot-1来作为封闭对照。如果cot-1点几乎无信号．就说明封闭完全。另外，还可以用oligo-dA，oligo-dT，质粒DNA或人类基因组DNA作为封闭对照。事实上，封闭对照就是一种阴性对照。

3.4.4 归整化对照在样本多的情况下标记探针时，很难十分精确地让所加RNA的量

相等。因此，就有必要设一对照，希望其杂交信号在不同样本杂交后是相同的。这相当于我们在作Northern Blot时采用Actin或GAPDH作对照一样。通常在酵母基因表达实验中，采用总酵母基因组DNA作归整化对照。对人类基因来说．由于只有少部分基因表达，故用总基因组DNA时产生的信号会十分弱。因此，有人还是用Actin或GAPDH作对照。

4 成像分析

杂交以后，就要对基因芯片进行荧光成像分析。一般用激光共聚焦显微镜作为扫描

器．扫描器有激光光源，可以产生激发不同荧光染料的光(对Cy3为绿光，波长为540nm；对Cy5为红光，波长为650nm)。当然亦可以用其它设备，如CCD照像机，但效果不如激光共聚焦好。

在分析时，我们的目的是测量出阵列中每个点的相对荧光强度，其方法是将图像分

成对应于每个点的小块，然后测定每个小块中的平均荧光强度。两个样本中每个单元的相对量就是平均荧光强度比率。具体分析时采用计算机处理。应当考虑消除背景，校正相对荧光强度比率等。同时应当考虑上述的各种对照处理。

5 基因芯片中的常见问题及解决方法

虽然基因芯片具有很多优越性，但在实验中仍然会遇到很多问题。在应用时一定要

注意这些问题的发生。实践中，最好的办法是设立许多对照，以便及时发现井改正问题．同时，不管在什么情况下，在设计实验时都要计划在实验的每一步都进行重复，而不是简单地重复整个过程。因此，最好多准备些mRNA样品和基因芯片，以备重复使用。

基因芯片制作过程中最难解决的问题是只有在最后完成后才能发现问题。因此，应

采用小规模实验，确保每步正确后再大规模生产。这里，我们列出几种常见的问题：

1)点印点的形态不规则一个常见的问题是点上带有拖尾。这一现象可能是在用琥

珀酰封闭时浸泡过程不迅速，从而使DNA在清洗过程中结合到载玻片的其它部分。

另一个问题是在DNA点样处经常出现小空洞。这是在点印时点样吸头留下的小圈不均匀，从而使点的中央留下的DNA量相对较少。如果在重水合化时，延长时间，可以减少这个问题。

2)强背景信号在应用基因芯片时，经常会出现整个荧光背景很强导致图像模糊不

清的观象。这种情况有时是在整个区域，有时只在局部产生。如果整个片子都有强的荧光背景，则在杂交前系统地选择一下片子即可。如果只在基因芯片内产生强的荧光背景，则说明是探针的问题，可以增加杂交后清洗的次数。一般对赖氨酸氨基封闭不充分和探针中的沉淀物是引起背景的主要原因。这种情况会经常出现“反探针”现象，即高强度的荧光信号在没有DNA的地方出现。有时候，背景会出现一边亮，一边暗的情况，这说明片子放在溶液(特别是封闭液)中的位置不好。对于边缘有亮荧光背景的情况，可通过加大3×SSC的体积来加以消除。

3)局部信号偏弱在高亮背景问题出现的同时往往是特定信号减弱。这可能是探针

不均匀分布所致。杂交时液体中的气泡、载玻片和盖玻片不平整都会产生局部信号偏弱的问题。

基因芯片是在基因组水平上发现和研究基因功能的强有力的工具。长期以来，生物

学家仅能够观察极少数基因在差异表达的情况。有了基因芯片技术后，生物学家就可以同时观察成千种基因的变化。对于整个基因组已知的生物，基因芯片技术就可以同时立即研究所有基因表达与调控的问题。对于人类基因研究来说，应用基因芯片技术的唯一限制是已知基因的数目问题。随着人类基因组计划的完成，这一限制将不再成为问题，可以毫不夸张地说，现在我们可以很容易地设计实验来系统地探讨生物学中大量前人未涉及的领域。用本文所介绍的技术，在一个实验室，利用仅1年时间，人们就可测量到成千上万个不同基因表达的特性。这相当于过去整个生物学对基因认识的总和还要多。

当然，一项技术并不是完美元缺的。基因芯片技术除了具体上述提到的技术问题外

。其成本高，使用还不太灵活简便也是其主要执点。但我们相信，全世界相关领域科学家们的共同努力，这一技术会在实用性上加以提高，制作成本会逐渐降低．从而使一般普通生物学实验室都能实现这项先进技术的应用。

另外，需要提及的是，随着这一技术的应用，关于基因表达调控的信息就会剧增。

因此，对于生物学家来说，如何组织、处理．解释这些信息，就变得越来越重要，或许，就象人类基因组计划一样，需要生物学与数学家及计算机专家共同努力，从而开创生物学的新未来。

二、生物芯片技术的原理与应用

　　美国加州旧金山Affymetrix公司Fodor等从固相支持物上合成多肽中得到启发，灵活运用了照相平板印刷、计算机、半导体、激光共聚焦扫描、寡核苷酸合成、荧光标记、DNA分子杂交及分子生物学的其他技术研制成功丁世界上第一块DNA芯片。随后又酝酿了蛋白芯片、芯片实验室。生物芯片的出现充分体现了生物学技术与其他学科和技术的相互交叉和渗透。生物芯片技术是融微电子学、生命科学、物理学于一体的一项崭新技术，它使一些传统的生物学研究实验能在非常小的空间范围(指甲盖大小-“随身听”大小)内，以非常快的速度(几小时就可将一个人的不正常基因检测出来)完成。随着生物学技术的飞速发展，该技术越来越显示出巨大的潜力和诱人的前景。

1、生物芯片技术的基本原理

　　生物芯片中最早实现商品化的是DNA芯片。DNA芯片技术利用DNA分子可以变性、杂交的特性，通过DNA芯片上固定的探针或样品DNA与游离的样品DNA或探针杂交来推断未知的靶分子。杂交发生与否可采用荧光标记技术检测。蛋白芯片是生物芯片中极有挖掘潜力的一种芯片。它利用蛋白质分子间的亲和作用，检测样品中存在的特异蛋白。可在医学上应用的免疫芯片即是将抗体固定在芯片表面制备而成。但最理想的生物芯片是芯片实验室，它是一种微型化、无污染、全功能的“实验室”，包含了运算电路、显示器、检测以及控制系统，在“随身听”大小的一间“实验室”里可一次性完成芯片制备、样品处理、靶分子和探针分子杂交／亲和，以及信号检测、分析。

2、生物芯片的制备

　　生物芯片的制备利用了微阵列技术将成千上万的生物讯息密码集中到小块玻片、硅片等固相载体上组成密集分子阵列。下面以DNA芯片的制备为例，介绍生物芯片制备过程。

　　DNA芯片的制备。即在控制条件下将大量DNA分子有规则地排列到载体上，是DNA芯片技术应用的前提和关键。制备方法因DNA芯片种类不同而有异，大致可分为两类：一是原位合成法，即按预先设计的序列顺序有规律地在固相支持物上直接合成成千上万种不同的DNA片段，该法适用于寡核苷酸探针的合成；二是交联制备法，即利用由电脑控制的点样装置将预先合成或制备的探针、cDNA、基因组DNA等按一定的排列顺序点在经特殊处理的载体上，通过共价交联或非共价吸附固定核酸分子，诙法主要用于中、低密度芯片的制备，既适用于大片段的DNA，也适用于小分子的寡核苷酸。

　　原位合成法是目前制备高密寡桉苷酸芯片景为成功的方法，主要有光控合成和标准试剂合成两种途径。原位光控合成技术由Affymetrix公司开发，它应用了固相化学、光敏保护及光刻技术，合成排列规则、种类丰富多样的寡核昔酸阵列。该法中，利用光敏保护基保护核苷酸的5'羟基，光照射使之脱保护，DNA的合成只发生在脱去保护基的地方，光照的区域即为合成的区域，合成过程可由一系列光刻掩膜或“面具”(mask)控制(如图1所示)。

　　标准试剂合成原理与喷墨打印相似，喷印头根据芯片上不同部位探针序列的需要，将特定的碱基喷印到芯片的相应位置。

　　交联制备法根据排列设计，在固相表面点上不同的特测核酸分子或探针，利用它们与载体的交联将其固定在芯片上。点样可采用手工或自动方式，中、高密度芯片的制备须使用自动点样仪，目前自动点样仪速度可达2000单元／秒。

　　cDNA芯片的制备主要是利用cDNA与载体的共价交联或静电作用的非共价吸附，可采用多阳离子聚赖氨酸包被方法进行静电固定或紫外线照射等产生共价交联。寡核苷酸与蓑体表面的交联以共价方式为主，寡核苷酸合成时需引入交联的活化基团。交联制备法有较为明显的优点，制备方式直接，不需原位合成那样复杂的技术；点样的样品可事先纯化；交联的方式多样．可方便地设计、制备符合需要的DNA芯片。但制备过程中样品用量大、浪费也较严重。

3、生物芯片技术的应用

　　生物芯片技术可在许多领境内应用，有些已成熟，有些则还处于探索阶段。本文以DNA芯片技术的几个较为成熟的应用为例，简要介绍生物芯片技术在分于生物学、医学等领域内的应用。

　3.1 DNA测序

　　十几年前就已提出利用DNA；S片进行DNA测序。其依据是杂交测序原理，短的标记寡核苷酸探针(一般为18-50个核苷酸)与靶DNA杂交，计算机扫描分析杂交谱，从而重建靶DNA序列。带荧光标记的目标DNA与芯片上的探针杂交后，经检测器及处理器分析处理就可得出靶DNA序列(如图2所示)，一次可测定较长片段的DNA序列。DNA芯片技术具有快速、准确等特点，应用该技术进行杂交测序有其他方法无可比拟的优越性。Murk Chee等利用这种方法确证性地对人类线粒体基因组测序，证明其准确率达99％。

　3.2 基因诊断

　　已知人类有6000多种疾病与基因有关，所以基因诊断，特别是致病基因如癌基因、肿瘤基因等的诊断对人类的健康和发展至关重要。DNA芯片可用于大规模筛查由点突变、插入及缺失等基因突变引起的疾病(如图3所示)。用于基因诊断的芯片一般是针对靶基因而特别设计的。利用分子杂交进行特定基因的确认。

　3.3 基因表达研究

　　为了阐明基因有序表达的调节机制，需要研究各种外界因素控制条件下的基因表达，井对单个细胞的表达进行检测。转录水平的变化能灵敏地反映细胞表达状态，如细胞类型、所处阶段及反应敏感性等。DNA芯片芯片可直接检测，mRNA的种类及其丰富度，该技术的快速发展和完善为mRNA水平研究的最终实现提供了可能性，是研究基因表达的有力工具。寡核苷酸芯片和cDNA芯片各具特点，它们都可用于转录物的检测。

　　已知人类有10万个左右基因，通过直接测序等手段来了解功能基因的情况非常费时费力，而改用功能基因转录出来的mRNA与芯片杂交来研究功能基因的表达，用一块芯片就可检测全部人类基因转录产物，进而研究基因表达。另外，黑色素瘤细胞系UACC-903表达基因的检测试验结果证明，利用DNA芯片技术研究基因表达与orthern杂交结果非常一致。

　3.4 后基因组研究

　　1996年完成了第一个真核生物酵母基因组的DNA测序；1998年底完成了第一个多细胞生物线虫基因组测序；1999年，英、美和日本的研究人员绘制出了人类22号染色体的蛋白编码基因完整序列，2000年初，人类21号染色体的基因序列也被完全测序；2000年6月26日，美国、英国、法国、德国、中国等国科学家共同宣布，绘制完成了人类基因组草图。研究的工作重点从基因结构方面的研究转向基因组功能的研究，标志着人类已进入了基因组测序完成后进行未知基因功能研究的后基因组时代。

　　人类基因组计划(HGP)正在以超过原定速度的进展实施，预计人类基因组的全序列测定能提前两年于2003年完成，到时，能在同一时刻检测上万乃至几万个基因功能的DNA芯片更被人们关注。

　3.5芯片实验宣的应用

　　芯片实验室可防止污染，使分析过程自动化，能大大提高分析速度和多样品分析能力，而且设备体积小，便于携带。

　　相信不久的将来，各种芯片实验室将不断涌现，利用芯片实验室将在生命科学、医学、食品检验防疫等方面不断取得突破。

4、应用前景

　　尽管生物芯片技术还处于萌芽期，但在国内也已经引起了足够的重视，由于其巨大的分析能力，极少的样品用量，简便、快速、高效的使用方式，未来的生物学研究越来越可能在生物芯片上进行。这种趋势表明许多基于囊胶和薄膜的方法将最终让位给生物芯片。

　　生物芯片技术的应用前景是乐观的。随着大量基因序列的确定，生物芯片技术为生物内部的生命信息的处理和应用提供了可靠的手段，对推动农业、人口、健康和环境等核心问题将发挥重大的作用。国外生命科学界、工业界和医学界等都认为生物芯片将会给21世纪整个人类生活带来一场“革命”。现在，又开发了几种新的生物芯片，如材料芯片、药材芯片等生物芯片

第六章突变

6.1 概述

一、定义

　　突变是一种遗传状态，可以通过复制而遗传的DNA结构的任何永久改变，都叫突变mutation 。所有突变都是DNA结构中碱基所发生的改变。

　　携带突变的生物个体或群体或株系，叫突变体mutant。

　　突变位点发生在基因内，该基因称为突变基因mutant gene；而没有发生突变的基因称为野生型基因wild type gene。

　　如arg+ 为Arg合成的野生型基因，而突变的基因型写成 arg-，即精氨酸合成缺陷型，其表型为 Arg-表现型。

　　野生型和突变体的表现型和基因型的表示方法见表5-1。P161

　　所有基因表型名称均用3个小写的斜体字母或小写字母在底下画线，而有关的具体基因则在3 个小写字母后用大写的斜体字母表示，如lacZ, lacZ?br>　　所有的表现型名称均用3个正写的字母表示（其中第一个字母大写），如Lac+ , Lac-。

　　还有一些其他的特殊意义的突变表示方法，如抗性，敏感性，温度敏感性，无意义等突变。-r, -s, Ts, 有兴趣的自己看。

　　引起突变的物理化学因素称突变剂mutagen。由于突变剂的作用而产生突变的过程或作用称为突变生成作用mutagenesis。简称突变

　　分类：

　　自发突变生成spontaneous mutagenesis——自发突变spontaneous mutation——自然突变体spontaneous mutant. 诱发突变生成，3. 简称诱变induced mutation——诱发突变induced mutaion——诱发突变体induced mutant.

二突变分类

　　从DNA碱基序列改变多少来分：单点突变和多点突变

　　从对阅读框架的影响来看：由于插入缺失一个或两个碱基会引起移码框架突变

　　从对遗传信息的改变来说：点突变可引起同一突变，错意突变，无义突变或无声突变（含中性突变和同8. 一突变）

　　从突变表型对外界环境的敏感性来区分，可分非条件型突变和条件型突变，如温度敏感突变为条件型突变。

　　从突变的效应背离或返回到野生型这两种方向来分：正向突变和回复突变

　　突变位点也可能存在于负责基因调控的DNA序列中：启动子上升突变和启动子下降突变。产生表达方式的操作子突变或调节基因的突变叫做组成型突变constitutive mutation.